[发明专利]槟榔芋软腐病的生防细菌筛选方法

权利要求书

1.槟榔芋软腐病的生防细菌筛选方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

S1、准备样品以及培养基

准备土样，其中土样取深度为10-15cm的健康槟榔芋植株根际土壤，带回备用，培养基为NA培养基；

S2、细菌的分离和保存

土样分离、纯化细菌：

称取10g土壤放入盛有90mL无菌水并带有20颗玻璃珠的150mL三角瓶中，振荡10min，即稀释度为10^-1的土壤悬浮液，吸取1mL的10^-1土壤悬浮液放入盛有9mL无菌蒸馏水的试管中，充分混匀，以此类推，再稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的稀释液，分别吸取上述稀释液100μL均匀涂于NA培养基平板上，每个稀释度涂布3皿，于37℃恒温培养箱倒置培养24-48h；

待长出菌落后，根据平板上长出菌落的形态颜色、质地等性状挑取不同的单菌落，纯化后接斜面试管4℃保存备用；

S3、生防细菌的离体球茎筛选

将分离纯化出的细菌和软腐病病原细菌分别接种于NA液体培养基中，于37℃、220r/min恒温摇床中培养8h备用。选取健康槟榔芋头，水洗并风干，切成约3×3×0.7cm的芋块，放入75％乙醇中消毒30s，再用0.1％升汞消毒5mins，无菌水充分洗涤5次，放入有滤纸的无菌培养皿中，每皿放入一组织块，备用。将软腐病病原菌液和待测菌液以1∶1比例混合，用无菌刀在芋块中央划深0.3cm十字伤口，将20μL混合菌液接种于十字伤口中。其中无菌水为阴性对照，软腐病病原菌液为阳性对照，重复3次，置于37℃恒温箱培养7d，观察记录病状。

S4、平板拮抗试验

1)滤纸法平板拮抗筛选：将100μL病原菌菌液涂布于NA培养基平板上，37℃恒温倒置培养24h，待长出菌苔后，再用5mm浸透生防细菌发酵液的滤纸，贴在菌苔上，每一皿等距放5片，以浸有无菌水的滤纸为空白对照，重复3次，37℃恒温培养1-2d，观察抑菌圈的有无及大小；

2)发酵菌液平板拮抗筛选：将100μL病原菌发酵液涂布于NA培养基平板上，37℃恒温倒置培养24h，待长出菌苔后，用直径为8mm的打孔器均匀打5个孔，取待测生防细菌发酵液注入孔中，以注入无菌水为空白对照，重复3次，37℃恒温培养1-2d，观察抑菌圈的有无及大小；

3)无菌发酵滤液平板拮抗筛选：将100μL病原菌发酵液涂布于NA培养基平板上，37℃恒温倒置培养24h，待长出菌苔后，用直径为8mm的打孔器均匀打5个孔，将待测生防菌发酵液7000r/min离心10min去除菌体，取上清液用细菌过滤器过滤除菌，得到无菌发酵液，在打孔处加入无菌发酵液，以注入无菌水为空白对照，重复3次，37℃恒温培养1-2d，观察抑菌圈的有无及大小；

S5、菌株16SrDNA分子鉴定

用细菌DNA提取试剂盒提取DNA后，用细菌通用引物进行PCR扩增，PCR产物委托公司测序，将测序所得的结果用DNAMAN进行序列分析，在NCBI上进行BLAST对比，用MEGA5构建系统进化树，确定菌种；

S6、菌株形态观察及主要生理生化特征

形态观察：菌落平板观察(形状、颜色、质地等)和光学显微镜下革兰氏、芽孢、鞭毛染色等观察；

生理生化：分别对细菌的需氧型、接触酶、明胶水解、淀粉水解、葡萄糖发酵、甘露醇发酵、V-P、吲哚、苯丙氨酸脱氨酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原等于37℃恒温培养后观察结果，最适pH(pH＝5-10)、最适温度(4℃、20℃、30℃、37℃、41℃、45℃、65℃)等于恒温培养菌液48h，每隔8h测一次菌液OD值，同时观察细菌生长状况，上述试验均做3次重复，上述生理生化试验具体如下：

1)需氧型：用无菌接种针将菌种竖直穿刺接种于NA培养基中，于37℃恒温培养24h，观察结果仅在试管琼脂柱表面生长的为好氧性菌，在琼脂柱表面和沿穿刺线都生长的为兼性厌氧菌，仅在试管底部生长的为厌氧性菌；

2)接触酶：接种在NA培养基后，37℃恒温培养24h。在载玻片滴加3％过氧化氢，再将新培养的菌种涂在该玻片上，如果观察到有气泡产生是阳性，没有气泡是阴性；

3)明胶水解：培养基蛋白胨5g，明胶100g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4。穿刺接种后在20℃以下室温中观察培养7天后的菌株，如果菌生长同时明胶表面为稳定凝块且无凹陷，则是明胶水解阴性。如果明胶凝块有可流动的液体，则是明胶水解阳性；

4)淀粉水解：在肉汁胨培养基中加0.2％可溶性淀粉，将新培养24h的菌种接在上述培养基平板上，37℃恒温培养5天，在形成明显的菌落时滴加碘液后出现蓝黑色，如果菌落周围出现不变色的透明圈的为淀粉水解阳性，如果还是蓝黑色为阴性；

5)葡萄糖发酵和甘露醇发酵：培养基(NH₄)₂HPO₄(1.0g)，KCl(0.2g)，MgSO₄(0.2g)，酵母膏(0.2g)，琼脂(5.0g)，葡萄糖或甘露醇(10.0g)，蒸馏水(1000mL),pH7.0-7.2。将菌种穿刺接种，培养5天后观察，滴0.04％溴甲酚紫指示剂变黄者，表示产酸为阳性，不变或变蓝为阴性；

6)V-P：接种在葡萄糖蛋白胨水培养基后37℃恒温培养两天，滴5-10滴40％KOH，振荡，再滴加等量5％α-萘酚溶液，振荡，最后放入37℃温箱中15-30min。观察和记录颜色变化，变红色为阳性；

7)吲哚：把培养24h的菌种接种在蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养48小时后，滴加3-4滴乙醚，摇动，静置3分钟，出现分层时再加2滴吲哚试剂，若三层的中间层产生红色环状物的是阳性反应；

8)苯丙氨酸脱氨酶：培养基酵母膏(3g)，NaCl(5g)，Na₂HPO₄(1g)，琼脂(12g)，DL-苯丙氨酸(1g)，蒸馏水1000mL，pH7.0，在37℃的恒温箱中培养4h，滴4-5滴10％的FeCl₃溶液，如果产生绿色的为阳性反应，不变则为阴性；

9)柠檬酸盐利用:培养基NaCl(1.0g)，MgSO₄·7H₂O(0.2g)，NH₄H₂PO₄(0.5g)，柠檬酸钠(2.0g)，蒸馏水(1000mL)，接种后于37℃恒温培养7天后，滴0.04％酚红液，如果观察到变为蓝或桃红色的是阳性，否则是阴性。

10)硝酸盐还原：培养基KNO₃(1g)，肉汁胨培养基1000mL，pH7.0-7.6。A液：对氨基苯磺酸(0.5g)、稀醋酸(150mL)；B液：α-萘胺(0.1g)、蒸馏水(20mL)、稀醋酸(150mL)。二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。将菌接种在上述培养基中，室温培养3-5天后，向培养液中滴A液和B液，溶液变红或橙色表示亚硝酸盐存在，为阳性反应；如果没出现红或橙色时再加1-2滴二苯胺试剂，此时出现蓝色表示没有硝酸盐还原作用，如不出现蓝色表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都还原成其他物质，是阳性；

S7、生防细菌的田间活体防效试验

将田里的槟榔芋松土并适量挖根部土，使其球茎部分露出，选择健康植株球茎，对其表面做清洁处理，将无菌细尖剪刀用75％酒精浸泡后，至酒精灯火焰处焙干，冷却后扎入球茎并旋转形成一圆柱伤口，菌液分别为病原菌液(对照)、病原菌和生防菌1:1混合液，用针筒吸取菌悬液缓慢打入伤口中，用细菌过滤膜密封，覆土并做好标记，使用过的剪刀和针筒不再重复使用，14d后观察球茎得发病情况。