[发明专利]一种具有单碱基分辨率的核酸修饰检测方法

说明书

本发明公开了一种新型多潜能的具有单碱基分辨率的核酸修饰检测方法，包括：S1.利用特异性结合修饰碱基的特异蛋白免疫沉淀待测核酸样本；S2.在步骤S1免疫沉淀后的体系中添加特异性识别错配结构的酶进行酶切反应；S3.将步骤S2的酶切产物电泳检测，若产生特异切割的条带，则判断待测核酸样本中存在该修饰碱基；反之则不存在该修饰碱基。本发明方法具有检测DNA和RNA上多种修饰潜能的潜能，所述方法不仅具有较高的检测精度，而且具有较高的可操作性和良好的稳定性。此外，还可以实现低至皮克级别的样本投入，并且在一定程度上具有量化单个碱基修饰水平的潜力。

技术领域

本发明涉及核酸修饰检测技术领域，更具体地，涉及一种新型多潜能的具有单碱基分辨率的核酸修饰检测方法。

背景技术

核酸修饰是指在DNA或RNA碱基上引入额外的化学基团的修饰方式，它不改变基因序列的排列方式却极大地提高了碱基的编码遗传信息的能力。到目前为止，已经先后发现了几十种不同的DNA修饰和上百种不同的RNA修饰。这些修饰在“编写器”蛋白或“擦除器”蛋白作用下在核酸上进行添加或者去除化学修饰基团，并被作为“阅读器”的蛋白进行识别发挥功能。近期有越来越多的研究表明，多种DNA和RNA修饰主动参与了多种生命过程的调控，包括胚胎发育、器官分化等。这些修饰失调有可能会导致人类疾病，甚至死亡。然而，核苷酸修饰的研究多年来一直进展缓慢，其中发展受限一个主要原因是很多修饰的丰度相对较低，使得大多数修饰很难检测和研究。例如，5mC作为哺乳动物中最丰富的DNA修饰，约占总DNA碱基的1％。N6-甲基修饰(6mA)是另一种重要的DNA修饰，最初被认为是细菌中最普遍的DNA修饰，但是，最近研究发现，在一些真核生物中也存在这种修饰，含量要比在细菌中的修饰比例少很多。而mRNA上最丰富的修饰m6A，仅占所有腺苷碱基的0.1～0.4％，其他类型的修饰比例则更低。此外，这些微量的碱基修饰是高度动态的，有时是可逆转的，会随着生理条件的改变或发育阶段而异。因此，积极开发创新方法来检测和定位它们的精确位点是研究这些难以捉摸的修饰的关键。

随着生命科学研究的深入，核酸修饰在基因表达调控中所起的作用越来越受到人们的关注。与编码核酸的调控方式不同，它有着特殊而庞大的调控机制，而解析核苷酸修饰的基因组定位则是研究其功能的关键。由于核酸修饰的种类繁多，对应的化学性质各有不同，因此每一种修饰的检测方法的也有很大差异。以m6A为例，它与没有发生修饰的A碱基的组成基本一样，它不能通过普通碱基配对策略与没有修饰的A碱基区分开。因此，近年来出现了许多新方法来绘制基因组或转录组的各种修饰图谱。通常将这些方法归为3类，包括抗体富集法、化学反应法、酶识别反应法。其中，抗体富集法原理是利用特异性比较好的抗体对有特异性修饰的DNA或RNA片段具有较高的亲和力的特性，便于后续的免疫共沉淀进行富集从而获取修饰片段的信号。这些富集方法已广泛应用于各种修饰的分析，包括DNA中的5mC(MeDIP-seq)和RNA中的m6A(MeRIP-seq)等。然而，基于抗体富集的方法最大的局限性是分辨率较低，只能定位到～100nt长度范围，而不能定位到准确的位置。化学反应法是根据修饰碱基或未修饰碱基本身参与化学反应的特性进行区分的。例如，在修饰检测中运用最成功和最广泛的化学反应法是5mC的bisulfite测序(BS-seq)，它的作用原理是用化学试剂重亚硫酸盐处理后，胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，经过逆转录和PCR扩增转化，尿嘧啶(U)会被识别为胸腺嘧啶(T)，但不影响5mC，经过这个方法就可以分析得到基因组中5mC的分布图谱。但是，化学反应的缺点也很明显，例如，化学反应的处理条件通常都很苛刻，容易对核酸链造成不可逆性的破坏。另外，特异性不足也是一个严重的问题，因为有些修饰碱基和正常碱基之间的差异不足以使化学试剂进行特异性的区分和反应。酶识别反应法是利用天然的酶能识别体内某些修饰类型的特性，从而进行切割或者停止切割反应来区分修饰碱基和未修饰碱基的基序。例如，限制性内切酶属于限制修饰系统(RM系统)，利用修饰作为识别内源DNA和外来入侵物的标志。利用这一特性，研究者们已经建立了基于某些修饰敏感的限制性内切酶来绘制5mC和6mA的方法；专利CN110029149A公开了一种鉴定碱基修饰的方法，是利用能够特异性的区分修饰和非修饰的待鉴定碱基的核酸酶对待测核酸样本进行酶切，但是其仅适用与RNA修饰检测，却并不适用于DNA修饰检测。与化学方法相比，这些酶识别反应法虽然具有更高的特异性和敏感性，但是，不是所有的修饰类型都能找到合适的酶和合适的工具蛋白进行鉴定，因此具有一定的局限性。