[发明专利]一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒

权利要求书

1.一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组，其特征在于，包括ASFVp72基因特异引物、ASFV CD2v基因特异引物和ASFV MGF基因特异引物；

所述ASFVp72基因特异引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物p72-F和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物p72-R；

所述ASFV CD2v基因特异引物包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的正向引物CD2v-F和如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的反向引物CD2v-R；

所述ASFV MGF基因特异引物包括如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的正向引物MGF-F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物MGF-R。

2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，还包括探针组；

检测ASFVp72基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

检测ASFV CD2v基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

检测ASFV MGF基因用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求2所述引物组，其特征在于，所述探针的5’端修饰有报告基团，所述报告基团为FAM、HEX和CY5；所述探针的3’端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3；三种探针采用不同的报告基团和猝灭基团修饰。

4.一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述引物组。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照标准品和多重qPCR扩增反应用试剂。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照标准品为包含ASFVp72基因片段的重组质粒、包含ASFV CD2v基因片段的重组质粒和包含ASFVMGF基因片段的重组质粒。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述ASFV p72基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述ASFV CD2v基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述ASFV MGF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述ASFVp72基因片段、ASFV CD2v基因片段和ASFV MGF基因片段通过多重PCR扩增获得；

所述多重PCR扩增的反应条件为95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃再延伸10min。

9.根据权利要求4～8任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品；所述阴性对照品为无RNA酶水。

10.一种同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株的分子标记，其特征在于，包括ASFVp72基因的分子标记、ASFV CD2v基因的分子标记和ASFV MGF基因的分子标记；

所述ASFVp72基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述ASFV CD2v基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述ASFV MGF基因的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。