[发明专利]一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物探针组，包括p72基因特异引物探针、CD2v基因特异引物探针和MGF基因特异引物探针。试剂盒包括引物探针组。采用试剂盒进行多重qPCR检测，ASFV的保守基因p72基因特异引物可扩增野生毒株和基因缺失疫苗株，而CD2v基因和MGF基因的特异引物只能扩增野生毒株，三对引物组合使用可实现同时鉴别ASFV野生毒株和基因缺失疫苗株。本发明具有检测准确、灵敏、高效率、成本低等优点，对临床样品的诊断及养殖业有较强的实用价值。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever，ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，病猪临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒粒子的直径为175-215nm，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170-190kb。目前，根据ASFV的p72基因(B646L)末端核苷酸的差异，可将ASFV分为24个基因型，基于病毒是否会引起红细胞吸附的特性，已鉴定出至少8个血清群。

ASFV可以通过受体介导的内吞作用或非特异性的巨胞饮作用入侵单核-巨噬细胞系统，通过抑制细胞凋亡、宿主免疫应答等策略逃逸宿主免疫防御系统。由于该病毒基因组巨大，功能性蛋白超过200个。因此，基因缺失疫苗被认为是短期内最有希望开发成功的疫苗，具有同源保护作用，同时也能抵抗异源毒株的攻击。2020年3月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所发文称遴选出一株具有7个基因缺失的病毒HLJ/18-7GD(缺失MGF505-1R，MGF505-2R，MGF505-3R，MGF360-12L，MGF360-13L，MGF360-14L，CD2v)，该缺失株符合弱毒活疫苗安全性标准，可对ASFV强毒株的致死性攻击提供有效免疫保护。军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所构建了多基因家族(MGF)和CD2v基因缺失的ASFV基因缺失疫苗候选株，接种猪能够100％抵抗亲本毒株SY18株的攻击。

目前，鉴定ASFV的方法主要是采用荧光定量PCR技术检测p72基因，无法区分ASF野毒株和基因缺失疫苗株。一旦确定是ASFV，扑杀焚烧是唯一的处理方法，以免造成更多猪群感染。因此，建立一种能够快速鉴别ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的诊断方法，是防控ASF的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组和试剂盒，具有特异性强、准确度高，低成本、灵敏度高、闭管操作安全可靠的特点，为ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的同时快速鉴别检测及有效防控ASF提供了新的途径。

本发明提供了一种基于多重qPCR技术同时鉴别非洲猪瘟野生毒株和基因缺失株用引物组，包括ASFV p72基因特异引物、ASFV CD2v基因特异引物和ASFV MGF基因特异引物；

所述ASFV p72基因特异引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物p72-F和如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物p72-R；

所述ASFV CD2v基因特异引物包括如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的正向引物CD2v-F和如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的反向引物CD2v-R；

所述ASFV MGF基因特异引物包括如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的正向引物MGF-F和如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的反向引物MGF-R。

优选的，还包括探针组；