[发明专利]一种拉萨小檗细胞培养中高产细胞系筛选、增殖的方法

说明书

本发明公开了一种拉萨小檗细胞培养中高产细胞系筛选、增殖的方法，本发明对特定培养周期内的拉萨小檗胚性愈伤组织以增殖倍率及盐酸小檗碱含量为指标进行筛选，选择增殖倍率高、稳产、高产细胞系并进行增殖，提取盐酸小檗碱；本发明以拉萨小檗胚性愈伤组织细胞系为材料，可用于细胞培养获得代谢产物，生产能力稳定、周期短，增殖倍数可达到7.7倍，小檗碱干重含量可达到2.8％，因此植物细胞培养对小檗碱工厂化提取有广阔的前景。

技术领域

本发明属于植物组织培养、植物细胞培养及天然药物化学技术领域，尤其涉及一种拉萨小檗细胞培养中高产细胞系筛选、增殖的方法。

背景技术

拉萨小檗(Berberis hemsleyana Ahrendt)又名三颗针，是小檗科小檗属灌木，主要生长于我国青藏高原高海拔地区，据伊尼岩和卢晓东《拉萨、林芝、山南地区三棵针资源》调查，尤其以日喀则、拉孜、拉萨、山南、林芝地区资源最为丰富,另据贺家仁和刘志斌《甘孜州高等植物》记载，四川巴塘县中心绒地区也有分布。拉萨小檗对环境适应性强，耐旱耐荫，对水分和光照条件要求不严,在海拔3000m至5000m之间的高原地带分布广泛。拉萨小檗根茎部位的皮可入药，主治赤痢、黄疸、咽痛、目赤、跌打损伤。据研究发现，拉萨小檗富含小檗碱(黄连素)，是其主要的药效活性成分，其小檗碱含量在众多小檗属植物中名列前茅。

为了既能满足人们对植物次生代谢物的需求,又能合理开发利用自然植物资源和保护生态环境,植物细胞培养成为生产植物次生代谢物的关键技术。现有关于拉萨小檗的已公开技术尚为空白,利用拉萨小檗生产小檗碱可通过植物细胞大规模培养次生代谢产物，应用细胞培养技术将外植体脱分化诱导为愈伤组织，筛选增殖倍率高、稳产、高产的细胞系大量增殖，产生次生代谢产物，并进行小檗碱单体提取。因此使用细胞培养的方法生产小檗碱有广阔的前景。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题提供一种拉萨小檗细胞培养中高产细胞系筛选、增殖的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种拉萨小檗细胞培养中高产细胞系筛选、增殖的方法，包括以下步骤：

A、选择继代培养基(MS+BA 0.3mg/L+NAA 1.0mg/L，琼脂5.2g/L，蔗糖20g/L，pH5.8)中，26℃培养14～21d的拉萨小檗胚性愈伤组织为培养材料；

B、将拉萨小檗胚性愈伤组织分成直径0.5cm的小区块接种于相同继代培养基(MS+BA 0.3mg/L+NAA 1.0mg/L，琼脂5.2g/L，蔗糖20g/L，pH5.8) 上培养；

C、将步骤B培养18d的小区块中选择最鲜黄的愈伤组织，一半用来检测分析，另一半继续继代的在培养基(MS+BA 0.3mg/L+NAA 1.0mg/L，琼脂 5.2g/L，蔗糖20g/L，pH5.8)中培养；

D、每18d继代筛选测定一次，如此不断地反复筛选、继代、扩大、测定，连续培养30代，最后得到生长速度快，小檗碱合成能力强的高产细胞系；

E、将选择出的稳定高产细胞系接种在增殖培养基上暗培养，扩大高产细胞系数量。

进一步，在步骤E中，所述增殖培养基为MS培养基、6-BA(6苄氨基嘌呤)0.1～0.3mg/L、NAA(萘乙酸)0.5～0.9mg/L、香蕉泥(香蕉去皮，然后将香蕉果肉捣碎成糊状)20-60g/L、琼脂5.5g/L、蔗糖20g/L，pH条件为 5.8。

进一步，在步骤E中，所述培养条件为每天24h遮光，培养时间为14～ 20d，培养条件为温度23～26℃、相对湿度为85％。

MS培养基成分