[发明专利]基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，先提取杀菌型乳制品的DNA，然后通过高通量测序技术结合生物信息学方法分析杀菌型乳制品中益生菌携带的耐药基因。

2.如权利要求1所述的基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、提取杀菌型乳制品的DNA；

步骤二、采用高通量测序技术获得所述杀菌型乳制品的DNA的原始序列；

步骤三、采用高通量测序技术获得所述杀菌型乳制品的DNA的优化序列；

步骤四、采用高通量测序技术对优化序列进行拼接组装和基因预测，并结合生物信息学方法进行物种和功能上的注释以及分类，从而获得菌型乳制品中乳酸菌耐药基因。

3.如权利要求2所述的基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，所述步骤三的优化序列是对步骤二的原始序列进行拆分、质量剪切以及去除污染等优化处理获得。

4.如权利要求1-3任一项所述的基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，步骤一所述的杀菌型乳制品的DNA的提取方法，包括：

步骤A、预处理：将所述的杀菌型乳制品的DNA样品与无菌蒸馏水以体积比为1:9的比例混匀，取5-10mL的样品加入到离心管中，高速离心，去上清；沉淀中加入5mL无菌蒸馏水，在涡旋振荡器上将沉淀混匀，混匀液放在沸水中加热，直至蛋白质絮状物出现，高速离心，去上清；沉淀中加入5mL无菌蒸馏水溶解，涡旋振荡器上混匀，再次在沸水中加热10min，高速离心，去上清。

5.如权利要求4所述的基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，预处理步骤中的高速离心方式为9000g离心5min。

6.如权利要求4所述的基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，所述杀菌型乳制品DNA的提取方法，还包括：

步骤B、往预处理后的沉淀中加入400μL浓度为10mg/mL的溶菌酶与20μL蛋白酶K，37℃水浴2小时；再加入400μL CTAB，56℃水浴过夜；

步骤C、样品中加入体积比为25:24:1的tris酚：三氯甲烷：异戊醇，高速离心；

步骤D、将上清移至新的离心管中，并加入体积比为24:1的三氯甲烷：异戊醇，13000rpm离心10min；

步骤E、将上清移至新的离心管中，加入2倍体积的无水冰乙醇；并在冰箱冷冻室放置20min左右；

步骤F、取出离心管，高速离心，去上清，在沉淀中加入1mL70％的乙醇清洗2-3次，沉淀晾干，加入50μL的TE溶解，得到DNA溶液，-20℃保存备用。

7.如权利要求6所述的基于高通量测序技术快速获得杀菌型乳制品中益生菌耐药基因的方法，其特征在于，步骤C采用13000rpm高速离心10min，步骤F采用13000rpm高速离心5min。