[发明专利]幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途

权利要求书

1.一种用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如HPA-2中所示：

HPA-2：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGTTACCAGGAGGACCCTATTCTCG

TGTATCGACGAGATCCAGTGACCACGACGACACACCCTAA-3’。

2.根据权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体，其特征在于，对核酸适配体进行突变或改造，使其能用于幽门螺旋杆菌的检测。

3.根据权利要求2所述的用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体，其特征在于，所述的突变或改造方法选自：改造、磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化修饰；或者添加生物素、地高辛、荧光物质、淬灭基团、纳米材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记以用于幽门螺旋杆菌的检测。

4.根据权利要求1或2所述的用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体，其特征在于：荧光标记的核酸适配体互补链长度在10%-25%之间。

5.根据权利要求4所述的用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体，其特征在于：荧光标记的核酸适配体互补链如下：

。

6.一种用权利要求1－5中任何一项所述的用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体进行幽门螺旋杆菌检测的方法，其特征在于：将待测样品与标记的核酸适配体混合后检测相应的数值，与空白比较并作出判断。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：将标记了淬灭基团的核酸适配体与荧光标记的互补链固定在聚苯乙烯板，用于检测，待测样品加在含有核酸适配体板上后，混合，在波长为450-500 nm的蓝光下检测，与空白比较并作出判断。

8.一种如权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌特异性检测的单链DNA核酸适配体的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1) 合成一个长度为80nt的初始文库和PCR所需引物；

(2) 用10%变性聚丙烯酰胺凝胶dPAGE纯化所有寡核苷酸，用DNA洗脱缓冲液从凝胶中提取，提取的DNA文库通过乙醇沉淀进一步浓缩；

(3) 将步骤（2）处理的文库用结合缓冲液浓度稀释为600 pM，在95℃变性5分钟，立即冰浴10分钟；

(4) 用200 μL缓冲液洗幽门螺旋杆菌两次，然后100 μL缓冲液重悬；

(5) 将步骤（3）处理的文库取100 μL加入步骤（4）重悬沉淀溶液混合，37℃以120 rpm孵育60分钟；

(6) 步骤（5）结合后，以5000 g离心5分钟，去除未结合的ssDNA，用结合缓冲液漂洗三次；悬浮液95℃孵育5 min，置于冰上10 min,

(7) 步骤（6）漂洗后，用100 μL水重悬，在95℃变性5分钟，立即冰浴10分钟，5000 g离心10 min，回收上清；

(8) 用糖原为载体的冰乙醇将步骤（7）处理的溶液醇沉并干燥，加入超纯水重溶；

(9) 将步骤（8）纯化得到的溶液作为模板进行PCR扩增；

(10) 用冰乙醇将步骤（9）处理的溶液醇沉并干燥，加入超纯水重溶；

(11) 将步骤（10）得到的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳和Bio-Rad GelDocTM EZ成像仪检测；

(12) 将步骤（11）检测后的PCR扩增产物按步骤（10）进行醇沉；

(13) 将步骤（12）得到的产物作为模板进行不对称PCR；

(14) 重复步骤（3）至步骤（13）9轮，第九轮至步骤（11）时进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行高通量测序；

(15) 将测序得到的序列进行聚类分析，合成出现拷贝数高的序列，并在5’端添加FAM标签；

(16) 将步骤（15）合成的9条序列用结合缓冲液稀释至100 nM并与幽门螺旋杆菌结合，选出结合量较多的序列；

(17) 将步骤（16）中亲和力较高的序列稀释为不同浓度，与相同浓度的幽门螺旋杆菌合进行亲和力分析；得到亲和力最高的一条序列HPA-2。

9.一种单链DNA核酸适配体的用途，其特征在于，单链DNA核酸适配体的核苷酸序列如权利要求1中HPA-2中所示，所述的用途为将HPA-2用于幽门螺旋杆菌特异性检测。