[发明专利]一种耳聋基因检测方法及其应用

权利要求书

1.一种耳聋基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待测样本的基因组DNA；

S2：PCR扩增杂交产物：采用不对称PCR扩增，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，反应总体系为25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/LdNTP3.0μL，10μm/L的荧光标记下游引物4.0μL，10μm/L的上游引物1.0μL，DNA模板2.0μL，Ex Taq TM酶0.25μL，灭菌水12.25μL，PCR扩增反应条件：94-95℃变性5min，94-95℃变性1min，58~60℃退火30s，70~72℃变性1min，共30~35个循环，最后70~72℃延伸10~12 min；

S3：PCR产物与基因芯片杂交；

S4：基因芯片的结果分析；

所述基因芯片含有耳聋突变基因的特异性探针；所述耳聋为药物性耳聋或遗传性耳聋。

2.根据权利要求1所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的提取方法为：A1：样本处理：将体积比为1:1的脑积水样本与第一缓冲液混合、45～50℃孵育15～20min、离心去上清后，加入第一缓冲液和溶菌酶37℃孵育30min～1h，再经20mg/ml蛋白酶K与10wt％CTAB 37℃处理20～30min，然后加入浓度为20％的阴离子表面活性剂，60℃裂解细胞1～2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀；

A2：样本混合：在步骤S1所得沉淀中加入第二缓冲液和浓度为20％的硬脂酸钠混合、60℃水浴15～20min然后-80℃冷冻10～15min，反复冻融三次后，离心取上清液，与步骤S1所得上清液混合；步骤S1所得沉淀与第二缓冲液的体积比为1:1；浓度为20％的阴离子表面活性剂与第二缓冲液的体积比为1:1；

A3：DNA提取和纯化：加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇抽提蛋白，再用异丙醇进行沉淀1～2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心TE洗脱后收集离心管中液体，即为脑积水微生物宏基因组DNA溶液；

所述第一缓冲液的pH为7.5，包括0.2M EDTA2Na，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1MNaH2PO4和0.1M Na2HPO4；

所述第二缓冲液的pH为7.5，包括0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1MNaH2PO4、 0.1M Na2HPO4和1wt％CTAB。

3.根据权利要求2所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，所述步骤A1中，所述裂解细胞的时间为1.5h；所述步骤A3中，所述TE洗脱的次数为1~3次；所述步骤A1和A2中所述阴离子表面活性剂为硬脂酸钠和/或十二烷基硫酸钠；所述硬脂酸钠和十二烷基硫酸钠比例为1：2；所述步骤A1中，经20mg/ml蛋白酶K与CTAB 37℃处理20min中，边振摇边混匀，所述振摇频次为1min/次。

4.根据权利要求1所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，所述步骤S3的杂交方法为：将杂交产物用PCR扩增产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴10min，全程避光；取PCR扩增产物40μL和杂交缓冲液160μL加于离心管中，混匀后将该混合液加至芯片的点样区，将芯片放入杂交盒内，置于46℃杂交箱中避光杂交1h；S4：基因芯片的洗涤与干燥：基因芯片的洗涤应在暗室中完成，杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用第一洗液、第二洗液、第三洗液以及第四洗液各浸泡2min，上下抽提20次洗涤后离心干燥。

5.根据权利要求1所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，所述步骤S4结果分析方法为：将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值，基因芯片杂交结果判定的依据如下：模板DNA的PCR扩增效果良好；信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；样点信号阈值SNR≥1.5，杂交信号良好。

6.根据权利要求1所述的耳聋基因检测方法，其特征在于，所述基因芯片至少包含一个阳性对照和一个阴性对照。