[发明专利]UPLC法同时检测柱花草中4种次级代谢物的方法有效

专利信息
申请号: 202011046736.4 申请日: 2020-09-29
公开(公告)号: CN112147260B 公开(公告)日: 2022-09-02
发明(设计)人: 邹冬梅;蒋昌顺;尹青春;潘永波;邓浩 申请(专利权)人: 中国热带农业科学院分析测试中心
主分类号: G01N30/02 分类号: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34
代理公司: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 温可睿
地址: 571101 *** 国省代码: 海南;46
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摘要:
搜索关键词: uplc 同时 检测 花草 次级 代谢物 方法
【说明书】:

发明涉及UPLC检测技术领域,尤其涉及UPLC法同时检测柱花草中4种次级代谢物的方法。本发明提供了柱花草中次级代谢物的检测方法,包括采用乙酸铵水溶液和甲醇作为流动相,在优化的洗脱梯度以及前处理方法后,取得了良好的检测效果,能够同时对柱花草中的水杨酸、吲唑、原苯甲酸三乙酯和大豆甾醇B进行定性和/或定量的检测,且具有良好的准确性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及UPLC检测技术领域,尤其涉及UPLC法同时检测柱花草中4种次级代谢物的方法。

背景技术

柱花草(Stylosanthes spp.)是一种优良的热带豆科牧草,占世界热带、南亚热带地区人工草地牧草品种的三分之一,也是我国热区最重要的热带牧草,并形成了“北有苜蓿草,南有柱花草”的草业发展格局。主要用于畜牧、青草饲料、橡胶园果园覆盖作物及水土保持等。目前,关于柱花草的品种(系)、遗传多样性、基因鉴定、病害、评价与利用、育种等是研究热点之一。

柱花草的次级代谢物有很好的抑菌活性,但由于其种类较多,缺乏批量同时精准检测的方法。刘文超等人分离出柱花草中的8种次级代谢产物,发现水杨酸等对能造成柱花草毁灭性病害的炭疽菌有很好抑制作用。目前,水杨酸、甾醇等次级代谢产物检测方法有分光光度法、液相色谱法,液相色谱-质谱法、气相色谱-质法等;吲唑、原苯甲酸三乙酯等次级代谢产物的检测方法鲜有报道,同时检测以上4种次级代谢物的研究尚无报道。

发明内容

有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供UPLC法同时检测柱花草中4种次级代谢物的方法,该方法能够实现对柱花草中水杨酸、原苯甲酸三乙酯、吲唑和大豆甾醇B实现准确检测。

本发明提供了一种柱花草4种次级代谢物的检测方法,其包括:

柱花草经提取获得待测液,以超高效液相色谱法对待测液进行检测,色谱参数为:

C18色谱柱,检测器为二极管阵列检测器,检测波长210nm和/或240nm;

流动相A:乙酸铵水溶液,流动相B:甲醇;

梯度洗脱程序:

0~5.00min,流动相B的体积分数为40%;

5.00~5.01min,流动相B的体积分数由40%至98%;

5.01~6.00min,流动相B的体积分数为98%;

6.00~6.01min,流动相B的体积分数由98%至40%;

6.01~8.00min,流动相B的体积分数为40%。

本发明对流动相进行了筛选,对比了0.1%甲酸水/甲醇、20mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇、0.1%甲酸水/乙腈、20mmol/L乙酸铵水溶液/乙腈4种不同流动相体系对4种次级代谢物的分离及响应效果。结果表明:20mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇为流动相能将4种次级代谢物分离,相互干扰最小。

在样品的前处理步骤中,本发明采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈、乙醇、甲醇作为提取液,对比了4种次级代谢物的提取效果,结果表明:乙酸乙酯提取效果最好,甲醇提取效果次之。用甲醇作为提取液时,样品中杂质去除不够干净,基质中杂质峰干扰较大,水杨酸色谱峰不能和杂质峰完全分离。因此,本发明选择乙酸乙酯作为提取剂。

并且,本发明比较了EMR-Lipid、QuECHERS超滤净化柱、MgSO4-NaCl盐包、PSA-SPE、Mega BE-C18固相萃取柱、PSA固相吸附剂、C18固相吸附剂对同一柱花草样品的净化效果,结果表明,Cleanret S C18吸附剂在水杨酸净化方面与Mega BE-C18固相萃取柱无显著区别,其它三种代谢物的净化效果均优于后者,表现出最好的净化效果。因此,本文采用Cleanret S C18吸附剂进行样品的净化。

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