[发明专利]一种可溶性表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用

说明书

本发明公开了一种可溶性表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用。本发明人筛选不同来源的蛋白质二硫键异构酶，并将其与巯基氧化酶构建到同一个启动子控制下。通过添加氮末端标签策略优化这两种蛋白的表达，构建可溶性表达系统。在大肠杆菌中，该系统与目的蛋白重组猪羧肽酶原B共表达后，可实现猪羧肽酶原B的可溶性表达，大大减少了包涵体的形成。该可溶性表达系统也可用于其它目的蛋白，例如胰蛋白酶原的可溶性表达，具有促进目的蛋白可溶性表达的通用性。本发明内容在重组蛋白生产和新酶原件筛选等领域具有应用前景。

技术领域

本发明属于重组蛋白表达领域，更具体地，本发明涉及一种可溶性表达系统，及其构建和在包括重组猪羧肽酶原B在内的蛋白可溶性表达上的应用。

背景技术

蛋白酶在药物生产、科学研究领域具有重要作用，羧肽酶B(CarboxypeptidasesB，CPB)是一种含金属锌的蛋白酶，可水解蛋白质或多肽类底物C端的精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)，在药物生产、科学研究以及急性胰腺炎的诊断等方面具有重要作用(Francesc XAvilés,Josep Vendrell,Alicia Guasch,Miquel Coll,Robert Huber,Advances inmetallo-procarboxypeptidases.European Journal of Biochemistry,1993,211(3):381–389；Lihui Deng,Lei Wang,Fengjiao Yong,Junjie Xiong,Tao Jin,Daniel De LaIglesia-Garcia,Shameena Bharucha,Kiran Altaf,Wei Huang,Qing Xia,Prediction ofthe severity of acute pancreatitis on admission by carboxypeptidase-Bactivation peptide:A systematic review and meta-analysis.ClinicalBiochemistry,2015,48(10-11):740–746)。特别是在胰岛素原转化为胰岛素的过程中，CPB是不可缺少的工具酶之一(Manuel Mansur,Liliam Martínez,Mariela Pérez,MadayAlonso-del-Rivero,Isvaloy Márquez,Yanay Proenza,Laura Varas,Francesc X.Avilés,Expression,purification and characterization of porcine pancreaticCarboxypeptidase B from Pichia pastoris for the conversion of recombinanthuman insulin.Enzyme and Microbial Technology,2007,40(3):476–480)。

目前，活性CPB的制备方法主要分为两种，一种是直接从猪胰腺中提取并纯化，但是这种方法价格昂贵，且制品中残留其它酶类或病毒等，使得应用受到限制；另一种方法是利用微生物(原核表达系统或真核表达系统)发酵的方法表达CPB的酶原(proCPB)，纯化后去除N末端前肽获得具有催化活性的酶体(安宇，李节，李素霞，赵健，范立强，袁勤生.重组羧肽酶B及其包涵体溶解性的研究.食品与药品A，2007，9(10)：1–5；王德解，苗林，陈宏，李彦英，陈惠鹏，方宏清.鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定.生物工程学报，2007,23(1)：61–66)。相比于真核表达系统，原核表达系统尤其是大肠杆菌(Escherichiacoli)具有遗传背景清晰、基因工程操作手段成熟、细胞生长能力强等优点，是理想的外源蛋白表达宿主之一。但是，大肠杆菌所表达包括猪羧肽酶原B(proCPB)在内的很多外源蛋白均是以包涵体的形式存在于细胞中，后续还需对产物进行复性，操作复杂且复性率低(张笑岩，张会勇，范豪，李泰明，刘景晶，曹荣月.重组猪羧肽酶原B在大肠杆菌中的表达与复性研究.药物生物技术，2010,17(1)：39–44)。