[发明专利]一种用于检测泛素-蛋白酶体系统降解活性的生物探针

说明书

本发明公开了一种用于检测泛素‑蛋白酶体系统降解活性的生物探针，属于生物技术领域。所述生物探针由泛素与cpEGFP融合而成，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将GFP环状重排得到cpEGFP，作为发光基团，将泛素的结构变化与cpEGFP关联，泛素被磷酸化后进入收缩态，能够与cpEGFP发生相互作用，增强荧光，通过检测荧光强度变化反映泛素的结构变化；以cpEGFP N末端的‑SH作为linker与泛素C末端连接，对泛素的磷酸化响应更加敏感。该探针不仅可以用于相关的基础研究，还可用于泛素激酶激活剂、蛋白酶体抑制剂的筛选。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是通过构建一种荧光探针，实现细胞水平泛素磷酸化及泛素依赖的蛋白酶体活性的检测。

背景技术

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解，蛋白质先被泛素(多肽)标记，然后被蛋白酶体识别和降解，以维持细胞内的蛋白质稳态。以蛋白酶体为靶点的药物在抗肿瘤(通常需要抑制剂)和神经退行性疾病(需要发展增强剂)有重要的研发价值。

泛素依赖的蛋白酶体活性的检测方法，不仅可以用于基础研究，还可以用于药物筛选。在2000年已经有研究者设计了一个用于检测泛素依赖的蛋白酶体活性的探针Ub-linker-GFP，在探针中的泛素(Ub)能够连接更多的泛素，形成泛素链，被蛋白酶体降解，这一探针在基础研究中有较多的应用。此外，还有一些基于去泛素化的探针，如Ub-R-GFP，探针中的泛素被去泛素酶水解后，形成R-GFP，在GFP的Lys上，会被泛素化，随后被蛋白酶体降解。这些探针因为使用GFP，荧光强度较强，使背景荧光较高。

课题组前期研究发现，泛素可以被磷酸化，被磷酸化后的表现也是抑制泛素依赖的蛋白酶体。泛素依赖的蛋白酶体降解蛋白质包括两个过程:(1)对待降解底物的泛素化；(2)泛素链与蛋白酶体结合。当泛素被磷酸化后，泛素结构会出现收缩态和舒张态两个态，在中性pH值两个态各占50％。其中舒张态能够被继续泛素化形成泛素链，同时也能够与蛋白酶体结合，而泛素一旦处于收缩态，则泛素链不能被延长，已经形成泛素链的泛素处于收缩态，则不能与蛋白酶体结合。而上述探针的GFP本身无感受蛋白质结构变化的功能，无法实现泛素的磷酸化检测。

cpEGFP是将GFP原本的N-端和C-端连接，在新的位点进行切割，形成新的N-端和C-端，这样GFP的11个β片段进行了重排，使荧光发光基团被一个处于N-端的，能够动态开、合的盖子松松的盖住，随着与其N-端相连接蛋白质的结构变化而打开(荧光强度减小)和关闭(荧光强度增加)。cpEGFP的优势是自身的荧光强度低，背景荧光弱，其最大的特点是由于盖子能够开、合，能够反应关联蛋白质的结构变化，故一般被用于检测蛋白质结构域之间或者蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

因此，如何将泛素与cpEGFP有效结合使得cpEGFP的荧光强度与泛素的结构变化关联，是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够针对泛素-蛋白酶体系统泛素磷酸化检测的荧光探针，增加对泛素磷酸化检测的灵敏度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测泛素-蛋白酶体系统降解活性的生物探针，所述生物探针由泛素与环状序列改变的增强型绿色荧光蛋白融合而成；

所述环状序列改变的增强型绿色荧光蛋白的构建方法包括：将绿色荧光蛋白氨基酸序列的N-端和C-端连接，在绿色荧光蛋白的第144位与第145位之间断开，形成新的N末端和C末端，删除新的N末端的酪氨酸残基和天冬氨酸残基；

所述环状序列改变的增强型绿色荧光蛋白N末端的丝氨酸残基与泛素的C端进行连接。

本发明构建的生物荧光探针Ub-cpEGFP的工作原理如下：