[发明专利]一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用

权利要求书

1.一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，包括以下步骤：

（1）人结直肠癌组织的分离：将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；

（2）人结直肠癌类器官的培养：将上述细胞团与水凝胶混合；固化后加入人结直肠癌类器官培养液进行培养，获得人结直肠癌类器官；

步骤（1）中所述冲洗为使用0.5-1%聚维酮碘进行冲洗；

步骤（1）中所述酶消化所用的消化液为：1.25-1.75mg/mLIV型胶原蛋白酶、15-25μg/ml透明质酸酶、8-12μMY-27632、80-130μg/ml庆大霉素；

步骤（2）中所述水凝胶由Glycosil、Gelin-S及Extralink制成；所述Glycosil、Gelin-S及Extralink的浓度均为1%，所述Glycosil、Gelin-S及Extralink的体积比为2:2:1；

步骤（2）中所述人结直肠癌类器官培养液为含有B27、N2、GlutaMAX、5-15nM Gastrin、0.5-1.5mMn-acetyl cysteine、90-110μg/mL庆大霉素、1-1.5μg/mL两性霉素B、90-110μg/ml primocin、8-15μMSB202190、5-15μM Y-27632、45-55ng/ml EGF、4-6ng/mlFGF、4-6%FBS的DMEM/F12培养液。

2.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述转移培养液为含有0.5-1.5% FBS、400-600Μ/mL青霉素、400-600μg/mL链霉素、80-120μg/ml庆大霉素、10-15g/mL两性霉素B的DMEM培养液。

3.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述过滤为：使用100μm的细胞滤网去除未消化的组织团块，将滤液再次经过40μm的细胞滤网过滤。

4.根据权利要求1所述的一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，其特征在于，步骤（2）中所述细胞团与水凝胶混合后，细胞密度为6-10×10⁴个/每20μL水凝胶。

5.一种结直肠癌组织类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)人结直肠癌组织的分离

将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；

(2)人结直肠癌类器官的培养

将上述细胞团与水凝胶混合；固化后加入人结直肠癌类器官培养液进行培养；

步骤（1）中所述冲洗为使用0.5-1%聚维酮碘进行冲洗；

步骤（1）中所述酶消化所用的消化液为：1.25-1.75mg/mLIV型胶原蛋白酶、15-25μg/ml透明质酸酶、8-12μMY-27632、80-130μg/ml庆大霉素；

步骤（2）中所述水凝胶由Glycosil、Gelin-S及Extralink制成；所述Glycosil、Gelin-S及Extralink的浓度均为1%，所述Glycosil、Gelin-S及Extralink的体积比为2:2:1；

步骤（2）中所述人结直肠癌类器官培养液为含有B27、N2、GlutaMAX、5-15nM Gastrin、0.5-1.5mMn-acetyl cysteine、90-110μg/mL庆大霉素、1-1.5μg/mL两性霉素B、90-110μg/ml primocin、8-15μMSB202190、5-15μM Y-27632、45-55ng/ml EGF、4-6ng/mlFGF、4-6%FBS的DMEM/F12培养液；

(3)人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养

类器官培养第2天，将肿瘤相关成纤维细胞接种在水凝胶上，于共培养培养液中共培养，人结直肠癌类器官与肿瘤相关成纤维细胞的细胞数比例为(2-3):1。

6.根据权利要求5所述的共培养的方法，其特征在于，所述共培养培养液为含有B27、N2、GlutaMAX、10nMGastrin、1mMn-acetyl cysteine、100μg/mlprimocin、5％FBS的DMEM/F12培养液。