[发明专利]一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用

说明书

本发明公开了一种人结直肠癌组织类器官的培养方法，包括以下步骤：将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；将上述细胞团与水凝胶混合，固化后加入DMEM培养液进行培养即得人结直肠癌组织类器官。本发明中采用转移培养液、消化液及培养液中加入庆大霉素、两性霉素B、primocin等抗生素可减少微生物污染，体外培养获得人结直肠癌类器官的方法简便、快速、成功率高，类器官生长状态良好。并且公开了上述人结直肠癌类器官在药物测试中的应用，可通过将人结直肠癌组织类器官与肿瘤相关成纤维细胞共培养模型作为一种患者个体化药物测试平台。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人结直肠癌组织类器官的培养方法及其应用。

背景技术

人源肿瘤类器官(patient derived organoid,PDO)模型是近年来兴起的一种新型的肿瘤研究模型，Hans Clevers等在2009年首次提出利用基质胶在体外培养小鼠小肠隐窝上皮细胞和Lgr5+肠干细胞，可形成类似于肠腺的微型结构模拟体内小肠的结构和功能。研究显示，PDO与肿瘤组织标本间具有高度相似的基因组特征和肿瘤分子亚型；同时揭示了在单一患者水平进行基因型-表型分析的重要性。

目前所有类器官的建立几乎全部依赖于动物源性的基质胶作为三维培养支架。由于基质胶批次间微量组成成分的异质性、免疫原性及异种来源病原体转移风险等，严重阻碍了基质胶所培养的细胞及类器官在再生医学和高通量筛选等领域的临床应用。因此，探索更安全、稳定、可精确调控的培养材料对PDO的广泛应用具有重要意义。

Brian等报道了使用硫醇化透明质酸钠(thiolated HA)和含二硫化物的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGSSDA)的水溶液成功构建基于HA的水凝胶用于前列腺癌细胞培养；该材料合成成本低，组成成分精确可控，同时具有透明、稳定和多孔性，更能同时支持肿瘤细胞与间质细胞生长；该研究成功利用此基于HA的水凝胶作为前列腺癌肿瘤细胞与基质细胞多层培养的生物材料，构建了一种高通量的药物测试平台，但是目前为止还未有关于利用水凝胶体外建立人结直肠癌(CRC)类器官的研究报道。

PDO模型中只含有上皮细胞,而不含原肿瘤组织中的间质细胞，成为PDO最重要的缺陷，导致其在某些应用中的不精确的临床反应，严重阻碍了其在免疫防御的、肿瘤转移及侵袭、微环境调控等方面的应用。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)肿瘤微环境中最重要的组成成分之一，不仅为肿瘤上皮细胞提供物理支持，而且是肿瘤免疫、转移、耐药等关键功能的调节因子。结直肠癌PDO与CAFs共培养模型的研究，将为深入探索结直肠癌发生发展和以患者为中心的个体化药物治疗带来新的突破。

发明内容

本发明的第一个目的在于，克服现有技术的不足，提供一种更加简便、快速、稳定的分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法。

本发明的第二个目的在于，提供上述人结直肠癌组织类器官在药物测试中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供一种药物测试平台。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种分离和体外培养人结直肠癌组织类器官的方法，包括以下步骤：

(1)人结直肠癌组织的分离：将人结直肠癌组织冲洗后放入转移培养液中，清洗后剪切；进一步清洗后离心、酶消化、过滤、收集细胞团；

(2)人结直肠癌类器官的培养：将上述细胞团与水凝胶混合；固化后加入人结直肠癌类器官培养液进行培养，获得人结直肠癌类器官。