[发明专利]一种AACT基因过表达试剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种AACT基因过表达试剂在制备抑制肺癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于所述AACT基因过表达试剂的制备方法包括如下步骤：

1）以人cDNA文库为模板，设计带有EcoR I和Xba I酶切位点的引物，在启动子ATG前增加增强子序列GCCACC，PCR扩增得到产物编码区序列的AACT，即带有EcoR I和Xba I双酶切位点的目的基因AACT；

2）将pCS2-HA空载体用EcoR I和Xba I进行双酶切，用胶回收试剂盒回收酶切产物，得到线性化pCS2-HA载体；

3）将步骤1）得到的所述目的基因AACT与步骤2）得到的所述线性化pCS2-HA载体进行连接形成过表达载体pCS2-HA-AACT，即为所述AACT基因过表达试剂；

所述步骤1）中以人cDNA文库为模板，设计引物，利用重组克隆法进行PCR扩增AACT基因编码序列全长，PCR扩增目的基因的引物序列为：

上游引物为：

5′CAGACTACGCTGGCCGGCCAGAATTCGCCACCATGGAGAGAATGTTACCTCTCC3′，下划线部分为EcoR I酶切位点；

下游引物为：

5′GTAATACGACTCACTATAGTTCTACACTAGGCTTGCTTGGGATTGGTG3′，下划线部分为Xba I酶切位点；

PCR扩增目的基因的反应体系如下：

PCR扩增条件如下：

扩增30个循环，72 ℃后延伸5 min后，将PCR扩增产物进行电泳、用胶回收试剂盒回收产物，得到PCR产物即所述带有EcoR I和Xba I双酶切位点的目的基因AACT；

步骤2）中酶切体系如下：

步骤3）中所述的连接用到的是2×MultiF Seamless Assembly Mix重组连接酶，连接体系如下：