[发明专利]一种通过探针捕获富集核酸的方法

说明书

本发明提供一种通过探针捕获富集核酸的方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明公开了一种新型的核酸捕获探针组合，包括磁珠以及能够与磁珠相连的特异性寡核苷酸序列，所述特异性寡核苷酸序列能够与靶核酸通过碱基互补原理产生特异性结合。采用该核酸捕获探针组合，使其根据碱基互补原理与靶核酸特异性结合，形成靶核酸‑探针杂合体，然后经磁分离、洗涤，去除蛋白质和其他非特异核酸，能够得到富集纯化的靶核酸分子。本发明所述方法可以特异性地捕获目标基因，实现纯化和富集核酸目的，增加检测特异性和准确性，提高检测灵敏度，降低假阴性结果检出。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种核酸检测样本的富集方法。

背景技术

核酸检测法是通过查找患者的呼吸道标本、血液或粪便中是否存在外来入侵的病毒的DNA和RNA，来判断是否被病毒感染的方法，是新型冠状病毒感染确诊的金标准。

目前新冠病毒检测通常方式是使用病毒RNA提取试剂盒来提取新冠病毒的RNA，再以提取的RNA为模板进行荧光定量PCR检测。病毒RNA提取试剂盒的起始样本使用量是200μL，然后与反应缓冲液结合后经过树脂柱(或者磁珠)吸附方式分离样本中的RNA，经过洗涤后，使用50-100μL无核酸酶水洗脱，这个过程中样本RNA损失40-60％，所以洗脱后收集的浓度与原始样本浓度相当。在新冠病毒检测中，临床医生反映核酸检测存在较高“假阴性”，一些有疑似症状病人通常需要三到四次检测才能确诊为阳性。其中主要的一个方面是样本中的病毒载量很低.目前国内新冠病毒核酸检测试剂盒的最低检测限基本在300—1000拷贝/ML左右，而且对于处于如此低浓度的病毒载量的样本，检测结果经常CT值处于灰区，结果不好判读，需要重新进行检测。因此如果能够把新冠病毒核酸富集后作为扩增反应的模板将极大提高新冠病毒的检出率。

发明内容

针对上述不足，本发明设计了一种新型的核酸捕获探针组合，采用该核酸捕获探针组合，使其根据碱基互补原理与靶核酸特异性结合，形成靶核酸-探针杂合体，然后经磁分离、洗涤，去除蛋白质和其他非特异核酸，能够得到富集纯化的靶核酸分子。采用该方式可以特异性地捕获目标基因，实现纯化和富集核酸目的，增加检测特异性和准确性，提高检测灵敏度，降低假阴性结果检出。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种特异性的核酸捕获探针组合，包括磁珠以及能够与磁珠相连的特异性寡核苷酸序列。所述特异性寡核苷酸序列能够与靶核酸通过碱基互补原理产生特异性结合。作为可选方式，在上述核酸捕获探针组合中，所述磁珠通过活化羧基与所述特异性寡核苷酸序列相连。进一步的，选择通过EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化磁珠上的羧基，可以实现特异性寡核苷酸序列与磁珠的稳定结合，从而便于通过磁分离实现对靶基因的分离与纯化。

作为可选方式，在上述核酸捕获探针组合中，通过间接方式将特异性寡核苷酸序列交联到磁珠，例如通过链霉亲和素与生物素之间的相互结合作用、主客体配位作用、静电吸附作用等，可以实现特异性寡核苷酸序列与磁珠的稳定结合，从而便于通过磁分离实现对靶基因的分离与纯化。

作为可选方式，在上述核酸捕获探针组合中，包括链霉亲和素磁珠和生物素标记的特异性寡核苷酸序列。利用链霉亲和素与生物素之间的相互结合作用，可以实现特异性寡核苷酸序列与磁珠的稳定结合，从而便于通过磁分离实现对靶基因的分离与纯化。

作为可选方式，在上述核酸捕获探针组合中，上述特异性寡核苷酸序列与靶核酸结合的位点与核酸检测的靶点不同。所述特异性寡核苷酸序列与靶核酸的特异性结合不会对后续的核酸检测造成不利影响。

作为可选方式，被捕获的靶核酸为新冠病毒基因。

作为可选方式，在上述核酸捕获探针组合中，所述特异性寡核苷酸序列具体为以下序列中的一种或几种：