[发明专利]PR3、MPO、GBM融合蛋白及其构建方法、应用

说明书

本发明公开了PR3、MPO、GBM融合蛋白及其构建方法、应用，构建方法包括以下步骤：S1、重组全基因合成序列：依次连接PR3、MPO、GBM蛋白区段的核苷酸序列获得目的基因；S2、构建重组质粒：将步骤S1中获得的重组全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；S3、一次转染：将步骤S2中的重组质粒转染宿主细胞，获得重组杆粒；S4、二次转染：将步骤S3中的重组杆粒再次转染宿主细胞，获得第一代的杆状病毒；S5、表达：将步骤S4中的第一代的杆状病毒进行表达；S6、获得融合蛋白：将步骤S5中表达得到的细胞培养物进行筛选、纯化，获得融合蛋白。通过本发明所述方法构建的融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，减少漏检和错检。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及PR3、MPO、GBM融合蛋白及其构建方法、应用。

背景技术

ANCA(抗中性粒细胞胞浆抗体)是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分作为靶抗原的抗体，会引发原发性系统性血管炎，又称ANCA相关血管炎，此病主要累及中小血管。韦格纳氏肉芽肿、急性进行性肾小球肾炎、多动脉炎、溃疡性结肠炎和原发性硬化性胆管炎等原发性系统性小血管炎的发病与ANCA密切相关，同时对ANCA的检测也可大大提高肾血管炎的早期诊断率。抗PR3(蛋白酶3)抗体、抗MPO(髓过氧化物酶)抗体和抗GBM(肾小球基底膜)抗体的检测已成为高敏感性、高特异性的血清学检测项目。

PR3(蛋白酶3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29kDa。PR3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、IV型胶原等。此外，PR3能够通过组织蛋白酶G促进血小板活化，并使C1抑制剂失活。

MPO(髓过氧化物酶)是粒细胞分化过程中合成的一种血红素蛋白，是中性粒细胞的主要组成成分。MPO作为单链前体产生，随后被切割成轻链和重链。成熟MPO是由2条轻链和2条重链组成的四聚体。这种酶能产生对中性粒细胞的杀微生物活性至关重要的低盐酸。

GBM(肾小球基底膜)是肾脏肾小球的基底膜层。GBM是血管内皮细胞及足细胞基底层的结合，主要由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、内联蛋白和渗滤素组成。

目前ANCA三项的抗原均为单一抗原，在体外诊断试剂研发过程中无法实现同时检测，检测灵敏度和特异性较差，导致试剂成本过高、检测过程繁琐、患者疾病漏检错检、竞争力缺乏等不足。

发明内容

本发明目的在于提供PR3、MPO、GBM融合蛋白，该融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，以减少漏检和错检。

此外，本发明还提供上述PR3、MPO、GBM融合蛋白的构建方法、应用。

本发明通过下述技术方案实现：

PR3、MPO、GBM融合蛋白，PR3、MPO、GBM融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

PR3、MPO、GBM融合蛋白能够用于ANCA三项抗体的同时检测，有助于提高检测试剂盒的灵敏度和准确度。

PR3、MPO、GBM融合蛋白包括依次连接的PR3蛋白区段、MPO蛋白区段和GBM蛋白区段，PR3蛋白区段具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，MPO蛋白区段具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列表达，GBM蛋白区段具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列表达。

一种编码PR3、MPO、GBM融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

PR3、MPO、GBM融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：

S1、重组全基因合成序列：依次连接PR3、MPO、GBM蛋白区段的核苷酸序列获得目的基因；

S2、构建重组质粒：将步骤S1中获得的重组全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；