[发明专利]一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法

权利要求书

1.一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，其特征在于：建立以EFTUD2为靶点的化合物筛选细胞模型，在该模型上进行药筛，筛选出能够上调EFTUD2表达的化合物。

2.根据权利要求1所述的筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，其特征在于：建立以EFTUD2为靶点的化合物筛选细胞模型包括如下步骤：

S1、预测EFTUD2基因启动子序列：在UCSC数据库查询并提取人EFTUD2基因的基因组序列，用BLAST在线程序比对序列，利用EPD真核启动子数据库在线软件预测目的基因启动子位点，用Sequence Retrieval Tool获得hEFTUD2pro-0.5kb、hEFTUD2pro-1.0kb、hEFTUD2pro-1.5kb、hEFTUD2pro-2.0kb四个启动子序列；

S2、筛选活性启动子序列：通过全基因合成和高保真PCR法钓取各启动子序列，通过双酶切将目的序列同源重组进psiCHECK-2载体来构建双荧光素酶报告基因重组质粒；将重组质粒转染HepG2细胞，利用双荧光素酶系统检测筛选出活性最强的启动子序列；

S3、建立以EFTUD2为靶点的化合物筛选细胞模型：将活性启动子序列与萤火虫荧光素酶基因序列构建成融合基因，再同源重组进LV6载体并包装成LV6-Epro-LUC慢病毒；LV6-Epro-LUC慢病毒感染HepG2细胞，通过嘌呤霉素筛选以及有限稀释法获得Epro-LUC-HepG2单克隆细胞株，从而建立Epro-LUC-HepG2细胞模型；

S4、筛选有效上调EFTUD2表达的化合物：利用MTT实验检测受试化合物的细胞毒性并算出各化合物IC50值；受试化合物以各自IC50值作为终浓度在Epro-LUC-HepG2细胞模型上进行靶向药物筛选，通过荧光素酶检测读取荧光值并计算荧光素酶相对荧光强度来筛选出有效上调EFTUD2表达的化合物。

3.根据权利要求1所述的筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，其特征在于：所述能够上调EFTUD2表达的化合物为能够上调EFTUD2基因表达至2倍及以上的化合物。

4.根据权利要求1所述的筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，其特征在于：所述能够上调EFTUD2表达的化合物为能够上调EFTUD2基因表达至3倍及以上的化合物。

5.根据权利要求2所述的筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，其特征在于：S1预测EFTUD2基因启动子序列步骤中，选择包含27个内含子和28个外显子的ENST00000426333.6转录本来预测其调控转录序列。

6.根据权利要求2所述的筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，其特征在于：S2筛选活性启动子序列包括如下子步骤：

S21、EFTUD2启动子报告基因重组载体构建；

根据步骤S1前期预测的人EFTUD2基因启动子范围获取其转录起始位点上游-1至-2000bp的序列，分别选取0.5kp，1.0kbp，1.5kp，2.0kp四个序列片段，针对各序列引物设计，利用全基因合成2.0kp片段，并以合成的2.0片段作为反应模板，PCR扩增出0.5kp，1.0kp，1.5kp三个片段；将psiCHECK-2载体和目的序列用BglII和NheI双酶切进行连接构建EFTUD2启动子报告基因重组质粒；酶切所有重组质粒并进行琼脂糖凝胶电泳跑胶鉴定，经测序比对，验证正确无误；

S22、EFTUD2启动子活性分析；

以无义序列替换psiCHECK-2载体的SV40增强启动子启动RLuc表达的重组质粒作为阴性对照，以原psiCHECK-2载体作为阳性对照SV40增强启动子启动RLuc表达，将各重组质粒及各对照组质粒分别转染HepG2细胞，48小时后裂解细胞检测荧光，分析各组相对荧光活性，根据荧光强度选出活性最强的启动子序列用于后续实验。