[发明专利]一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法

说明书

本发明提出一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，通过以EFTUD2为靶点构建上调EFTUD2基因表达化合物筛选模型对候选化合物进行高通量筛选，为寻找一种或若干种能够有效上调EFTUD2表达的化合物提供了途径，为HBV慢性感染患者尤其临床IFN‑α治疗效果欠佳患者提供更多的治疗选择提供了希望。

技术领域

本发明涉及基因领域，具体地说是一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法。

背景技术

干扰素-α（IFN-α）是治疗慢性乙型肝炎的有效药物，其发挥抗病毒效用的机制是诱导细胞分泌抗病毒蛋白来清除乙型肝炎病毒。然而IFN-α治疗有明显的副作用，其治疗适应症也相当严格。与此同时，IFN-α治疗依赖于宿主完整健全的免疫系统方能有效发挥抗病毒作用，因此，IFN-α治疗的总体有效率并不高，临床常有IFN-α治疗应答不佳的慢性乙型肝炎（CHB）患者。

延伸因子TuGTP结合蛋白2（EFTUD2）是剪接体的重要组成部分，其功能是参与前体信使RNA（pre-mRNA）的剪接以产生蛋白翻译的直接模板。临床检测到IFN-α治疗应答不佳的CHB患者其肝组织EFTUD2表达水平低。EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因（ISGs）的转录翻译水平来抑制HBV复制。因此，建立一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，以及筛选出能够上调EFTUD2表达的化合物，为CHB患者中IFN-α治疗效果不佳者提供更多的治疗选择显得尤为重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明旨在建立一种能够筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，并运用该方法筛选出能上调EFTUD2表达的化合物，从而探索新的分子靶向免疫调节药物，为CHB患者中IFN-α治疗效果不佳者提供更多的治疗选择。

具体的本发明提出一种筛选上调EFTUD2表达的化合物的方法，建立以EFTUD2为靶点的化合物筛选细胞模型，在该模型上进行药筛，筛选出能够上调EFTUD2表达的化合物。

进一步的，建立以EFTUD2为靶点的化合物筛选细胞模型包括如下步骤：

S1获取启动子序列：在UCSC数据库查询并提取人EFTUD2基因的基因组序列，用BLAST在线程序比对序列，利用EPD真核启动子数据库在线软件预测目的基因启动子位点，用SequenceRetrievalTool获得hEFTUD2pro-0.5kb、hEFTUD2pro-1.0kb、hEFTUD2pro-1.5kb、hEFTUD2pro-2.0kb四个启动子序列；

S2筛选出活性启动子序列：通过全基因合成和高保真PCR法钓取各启动子序列，通过双酶切将目的序列同源重组进psiCHECK-2载体来构建双荧光素酶报告基因重组质粒；将重组质粒转染HepG2细胞，利用双荧光素酶系统检测筛选出活性最强的启动子序列；

S3建立以EFTUD2为靶点的化合物筛选细胞模型：将活性最强的启动子序列与萤火虫荧光素酶基因序列构建成融合基因，再同源重组进LV6载体并包装成LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，通过嘌呤霉素筛选以及有限稀释法获得Epro-LUC-HepG2单克隆细胞株，从而建立Epro-LUC-HepG2细胞模型；

S4筛选有效上调EFTUD2表达的化合物：利用MTT实验检测受试化合物的细胞毒性并算出各化合物IC50值；受试化合物以各自IC50值作为终浓度在Epro-LUC-HepG2细胞模型上进行靶向药物筛选，通过荧光素酶检测读取荧光值并计算荧光素酶相对荧光强度来筛选出有效上调EFTUD2表达的化合物。