[发明专利]一种角膜缘干细胞的体外扩增方法

权利要求书

1.一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将角膜缘干细胞组织块剪碎，于无菌环境中用Hank液冲洗2~3次，并将90~95%质量的角膜缘干细胞组织加入30～50倍体积消化液消化，弃去消化液；采用Hank液冲洗2~3次后，加入8~10倍体积的角膜缘干细胞培养基，终止胰蛋白酶消化；

（2）加入0.1~0.5倍体积的组织保护剂，以1000~1100r/min，离心8~10min，弃上清，取沉淀细胞；所述组织保护剂是采用角膜缘干细胞基础培养液DMEM，加入0.55~1.25ug/ml松果菊苷、1.5~2.5mg/mlβ-葡聚糖和2.2~3.8mg/ml L-谷氨酰胺混合而得；

（3）将沉淀细胞采用Hank液冲洗1~2次后，加入3~5倍体积的角膜缘干细胞培养基中重悬，并与5~10%未消化的角膜缘干细胞组织混合种植至有孔培养板中，于36~37℃，93~95%湿度，含5~5.5%CO₂培养箱中培养，隔天换液，得到角膜缘干细胞；

所述角膜缘干细胞培养基是采用角膜缘干细胞基础培养液DMEM/F12(1:1)，加入10~15%胎牛血清，2.5~3ml 100×青链霉素混合液，0.3~0.5mg/ml谷氨酸胺，5~8ug/ml胰岛素，15~25mg/ml运铁蛋白，0.2~0.5ug/ml氢化可的松，10~16ng/ml霍乱毒素，3~5ng/ml血小板衍生因子、1~3ng/ml 白介素-6和10~15ng/ml胰岛素样生长因子混合而得。

2.根据权利要求1所述的一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤（1）中，在加入角膜缘干细胞培养基终止胰蛋白酶消化前，先加入含有0.5~0.8%的胎牛血清的角膜缘干细胞基础培养液DMEM/F12(1:1)，置于37℃恒温摇床中反应3~5min，吸出细胞培养基。

3.根据权利要求2所述的一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述组织保护剂中含有1.05ug/ml松果菊苷、2.0mg/mlβ-葡聚糖和3.0mg/ml L-谷氨酰胺。

4.根据权利要求1所述的一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤（1）中，所述消化液为由1.25g/L 胰蛋白酶与0.2g/L EDTA 1: 1混合而得。

5.根据权利要求1所述的一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤（1）中，所述消耗时间为13~15min。

6.根据权利要求1所述的一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤（3）中，所述重悬细胞在有孔培养板中的接种密度为1×10⁵细胞/cm²。

7.根据权利要求1所述的一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤（3）中，采用4倍体积的角膜缘干细胞培养基中重悬，并与8%未消化的角膜缘干细胞组织混合种植至有孔培养板中。