[发明专利]一种角膜缘干细胞的体外扩增方法

说明书

本发明提供一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：(1)将LSCs干细胞组织块剪碎，冲洗，并将90～95％质量的LSCs干细胞组织加入30～50倍体积消化液消化，冲洗，加入8～10倍体积LSCs干细胞培养基；(2)加入0.1～0.5倍体积组织保护剂，离心，弃上清；(3)采用Hank液冲洗，重悬，并与5～10％未消化的角膜缘干细胞组织混合种植至有孔培养板中培养，得到角膜缘干细胞；本发明可有效保护酶解分离过程的离散角膜缘干细胞的作用，保持细胞增殖活力，使在分离过程中保持细胞稳定的增殖活性，实现角膜缘干细胞的整体高效稳定的体外扩增培养。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种角膜缘干细胞的体外扩增方法。

背景技术

随着生物组织工程研究的不断深入，在角膜的组织工程中，重建角膜上皮技术具有重要地位。角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)为角膜、结膜和巩膜的交界部分，角膜上皮的愈合是通过角膜缘干细胞移行和增殖来完成的。因此，对于角膜缘干细胞的体外培养是重建角膜上皮的关键。

但现有的角膜缘干细胞的体外培养体系的构建存在较多难点，在角膜缘干细胞体外扩增培养的过程中，容易受分离培养过程的影响而难以保持角膜缘干细胞体外扩增的稳定性，导致角膜缘细胞的增殖速度慢，培养周期长、传代数少、易污染等问题，无法达到高效稳定的细胞角膜缘干细的体外扩增效果，充分发挥角膜缘干细胞体外扩增培养的增殖潜能。因此，寻找一种更有效的角膜缘干细胞的体外扩增方法，为构建角膜缘干细胞的体外培养体系提供重要的基础。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种角膜缘干细胞的体外扩增方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种角膜缘干细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：

(1)将角膜缘干细胞组织块剪碎，于无菌环境中用Hank液冲洗2～3次，并将90～95％质量的角膜缘干细胞组织加入30～50倍体积消化液消化，弃去消化液；采用Hank液冲洗2～3次后，加入8～10倍体积的角膜缘干细胞培养基，终止胰蛋白酶消化；

(2)加入0.1～0.5倍体积的组织保护剂，以1000～1100r/min，离心8～10min，弃上清，取沉淀细胞；所述组织保护剂是采用角膜缘干细胞基础培养液DMEM，加入0.55～1.25ug/ml松果菊苷、1.5～2.5mg/mlβ-葡聚糖和2.2～3.8mg/ml L-谷氨酰胺混合而得；

(3)将沉淀细胞采用Hank液冲洗1～2次后，加入3～5倍体积的角膜缘干细胞培养基中重悬，并与5～10％未消化的角膜缘干细胞组织混合种植至有孔培养板中，于36～37℃，93～95％湿度，含5～5.5％CO₂培养箱中培养，隔天换液，得到角膜缘干细胞。

进一步说明，步骤(1)中，在加入角膜缘干细胞培养基终止胰蛋白酶消化前，先加入含有0.5～0.8％的胎牛血清的角膜缘干细胞基础培养液DMEM/F12(1:1)，置于37℃恒温摇床中反应3～5min，吸出细胞培养基。通过含有微量胎牛血清的角膜缘干细胞基础培养液DMEM/F12(1:1)对角膜缘干细胞进行预处理，有利于更好地保持细胞的增殖活力。

进一步说明，所述组织保护剂中含有1.05ug/ml松果菊苷、2.0mg/mlβ-葡聚糖和3.0mg/ml L-谷氨酰胺。将一定含量的松果菊苷与β-葡聚糖组合，有利于保护酶解分离过程的离散角膜缘干细胞的作用，并保持角膜缘细胞在体外分离过程的细胞增殖活性，提高细胞增殖稳定性。