[发明专利]一种诱导脂肪干细胞定向分化为人皮肤成纤维细胞的方法及用途

说明书

本发明提供了一种诱导脂肪干细胞定向分化为人皮肤成纤维细胞的方法，首先以分离的三代人脂肪干细胞为原材料，对其构建基于3D‑MTC的超分辨生物力学平台中并进行培养；然后通过基于3D‑MTC的超分辨生物力学平台对脂肪干细胞施加力学刺激，通过改变力学信号的参数设置，调控ADSCs向皮肤成纤维细胞定向分化。通过本发明的方法能够高效的定向分化得到人皮肤成纤维细胞，并且所得到的人皮肤成纤维细胞具备良好的稳定性、力学性能、耐久性，最重要的是，本发明所分化得到的人皮肤成纤维细胞作为移植物，在生物体中具备良好的皮肤创面修复能力和恢复能力。

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种用于诱导脂肪干细胞在模拟体内生长环境下培养及定向分化的方法，尤其涉及一种定向分化为人皮肤成纤维细胞的方法。

背景技术

应用种子细胞修复皮肤损伤是目前研究的热点之一。与骨髓、胚胎和脐带等种子细胞相比，脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells,ADSCs)在临床上获取简便微创、产量高，免疫原性低且不存在伦理限制，在特定条件下可定向分化形成皮肤细胞，为临床上皮肤损伤修复提供了新思路。脂肪组织在人体内储量丰富，通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞(ADSCs)，有自我更新增殖及多向分化潜能，可向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子而抗炎、抗氧化，可抵抗氧自由基的损伤，有望成为修复受损的组织和器官的干细胞来源。

目前关于ADSCs的定向分化实验研究已积累了相当程度的数据，临床的相关应用大部分研究关注了ADSCs的定向成脂、成骨分化，但是目前这些定向分化的方法大多都是采取的生化方法。传统研究中，单纯的生化方法诱导效率低且不稳定，同时尚未考虑皮肤细胞微环境中异常复杂力学因素。在血管组织工程早期研究中，人造血管的生物力学性能研究严重匮乏，导致人造血管难于适应生理微环境中的力学因素变化，在体内承受反复脉动等生理负荷下中容易破裂或散边。同理，用生化方法诱导ADSCs分化形成的皮肤细胞，能否承受生理强度的力学载荷及其力学适应性未知，在临床实践中用于皮肤损伤修复时，也可能不适应细胞微环境中不断变化的多种力学因素的作用。

随着科学的不断发展，力学微环境决定干细胞命运的证据逐渐增多，对干细胞体外分化影响的研究已从生化方法拓展至力学因素对干细胞分化的作用，除了可溶性分子之外，力学刺激和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的物理性质也可调节干细胞分化的转录因子的表达，生物力学与生物化学微环境协同调控了干细胞分化。

发明内容

本发明提供了一种诱导脂肪干细胞定向分化为人皮肤成纤维细胞的方法及用途，通过本发明的方法能够高效的定向分化得到人皮肤成纤维细胞，并且所得到的人皮肤成纤维细胞具备良好的稳定性、力学性能、耐久性，最重要的是，本发明所分化得到的人皮肤成纤维细胞作为移植物，在生物体中具备良好的皮肤创面修复能力和恢复能力。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种诱导脂肪干细胞定向分化为人皮肤成纤维细胞的方法，包括以下步骤：(1)、以分离的三代人脂肪干细胞为原材料，对其构建基于3D-MTC的超分辨生物力学平台中并进行培养；

(2)、通过基于3D-MTC的超分辨生物力学平台对脂肪干细胞施加力学刺激，通过改变力学信号的参数设置，调控ADSCs向皮肤成纤维细胞定向分化；具体的力学刺激信号参数为：频率：1～3Hz；幅度：30％；强度：12kPa；加力时间：8hours/d；加力角度：90°；加力方式：正弦波。

步骤(1)的具体构建方法为：(a)对视野下的椭圆形细胞确定范围，围绕细胞作一个能将细胞全部包含的面积最小的椭圆，以该椭圆长轴为细胞的长轴，建立相应的二维平面；

(b)设定平行于细胞长轴方向为二维坐标系的长轴，垂直于细胞长轴方向为短轴，加力方向与长轴之间的角度为θ；