[发明专利]一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法

权利要求书

1.一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；向洗涤后的脂肪组织中加入适量脂肪细胞消化液进行消化；消化后，离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；

所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。

2.根据权利要求1所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述脂肪细胞消化液，是由DMEM/F12培养基和Ⅰ型胶原酶组成的，Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1％～0.3％。

3.根据权利要求1所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述旁分泌因子提取液中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：2mmol/L，15μmol/L，50μmol/L。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述原代培养的具体方式如下：

(1)取采集的脂肪标本，离心；

(2)离心后，吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入生理盐水，离心；

(3)重复步骤(2)两次，得脂肪组织；

(4)向脂肪组织中加入等体积的脂肪细胞消化液，混匀，放入37℃摇床，100转/min消化1.0h；

(5)消化后，离心；弃掉上层脂肪，细胞沉淀用DMEM/F12培养基重悬，用40um滤网过滤细胞，离心；弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，计数，离心；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬，置于培养瓶中铺瓶培养；当细胞生长密度达到80％时，进行脂肪干细胞传代培养。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述传代培养的具体方式如下：

(1)取出培养瓶，吸弃旧培养基，于非细胞培养面加入适量生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；

(2)向培养瓶中适量胰酶或胰酶溶液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液终止消化；用100μm细胞筛网收集细胞，加入适量生理盐水，轻柔吹打后离心；弃上清，沉淀用适量生理盐水重悬，离心；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬铺瓶，保证接种细胞密度在8×10⁴/ml以上，置于培养箱中培养。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述扩大培养的具体方式为：对脂肪间充质干细胞进行扩大培养，在37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养。

7.根据权利要求6所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述扩大培养的具体方式如下：按照8×10⁴/ml细胞密度接种脂肪间充质干细胞于T75细胞培养瓶或细胞工厂，细胞工厂可以加脂肪间充质干细胞培养基400ml，1个T75培养瓶加培养基15ml；将细胞工厂放置于37℃、5％二氧化碳浓度、2％氧分压的环境中培养。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：用旁分泌因子提取液提取的具体方式为：培养72小时，细胞生长密度达到80％，将无血清培养基留存；细胞工厂加200ml盐水洗一次，T75培养瓶用10ml盐水洗一次，弃掉上清；每个细胞工厂加入200ml旁分泌因子提取液，每个T75培养瓶加入5mL PBS。