[发明专利]一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法

说明书

本发明公开了一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；加入适量脂肪细胞消化液进行消化；离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L‑谷氨酰胺、D‑葡萄糖和L‑抗坏血酸组成的，L‑谷氨酰胺、D‑葡萄糖和L‑抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。本发的方法可从脂肪组织中稳定的提取脂肪干细胞，并利用脂肪干细胞提取脂肪干细胞旁分泌因子，细胞质量和因子提取效率稳定，脂肪干细胞在GMP环境下分离并长期培养，不接触任何动物源性成分，可高效表达表达CD29、CD44、CD105等脂肪干细胞标志物。

技术领域

本发明涉及一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

旁分泌(paracrine)指某种细胞因子的产生细胞和靶细胞非同一细胞，但二者相邻近；该因子对靶细胞表现出的生物学作用即为旁分泌效应。旁分泌的信号分子包括生长因子、淋巴因子等。目前研究发现多种组织来源的干细胞都可分泌产生不同的细胞因子，即干细胞的旁分泌作用具有普遍性。

间充质干细胞已用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。间充质干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用(分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等)。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中起主要作用。间充质干细胞通过分泌各类细胞因子对邻近细胞产生作用，从而发挥其功效。研究证实间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、GDNF(胶质源性神经营养因子)等。间充质干细胞分泌的活性因子具有改善炎性环境、调节机体免疫状态、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管再生、促进脂肪干细胞迁移和分化等作用。

脂肪组织来源的干细胞(adipose stem cells，ADSCs)具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、具有多向分化潜能等优点，ADSCs逐渐成为近年来干细胞储存的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点，具有更大的应用潜能。大量研究证实：ADSCs能够增殖分化形成缺少损伤的细胞，拥有促进神经元再生，保护神经元的作用。ADSCs的分化结果证实其可被诱导分化成多种细胞，包括脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞和神经细胞等。越来越多的研究证明，ADSCs对多种疾病模型都具有积极的作用，如帕金森病、多发性硬化症、脑损伤。目前间充质干细胞治疗机制普遍认同是干细胞的迁移和分化能力，但新的研究结果证实更重要的是干细胞的旁分泌作用。ADSCs在体外培养能分泌多种因子，可以抑制神经元凋亡、促进神经细胞扩增、调节免疫反应。脂肪干细胞旁分泌因子(adipose-derived stem cell paracrine factor ASCF)来源于脂肪间充质干细胞，含有多种成分如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，各种实验研究也证实ASCF可以通过其包含的多种细胞因子抑制神经细胞凋亡、提高神经细胞再生能力，从而有利于神经损伤的修复。

目前行业内对干细胞旁分泌因子研究才刚刚起步，大都以研究阶段为主，未进行生产阶段转化，无明确的行业标准和生产质量标准，存在以下不足之处：旁分泌因子样本来源不规范，培养规模较小，质量层次不齐，诱导细胞因子分泌过程不够高效，分离纯化过程不具规模化，产品保质期短等，这大大限制了旁分泌因子的生产和使用。

发明内容