[发明专利]一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法

说明书

本发明公开了一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，属于生物技术领域。本发明首先对不同来源的ATP硫酸化酶和APS激酶进行优选，利用蛋白质融合技术，将优选所得的ATP硫酸化酶和APS激酶之间融合一段不同的蛋白接头(linker)，构建了双功能PAPS合酶。进一步对linker进行理性设计和改造，大大提高了转化效率，并简化了酶催化剂的获取，减少酶催化剂在制备过程中的损失。使得ATP转化率提高了25％，催化时间缩短59％。此外通过突变ATP硫酸化酶P环HRAH序列为HNGH和HAGH，进一步提高其酶活，使得PAPS的转化率可达48％。

技术领域

本发明涉及一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，属于生物技术领域。

背景技术

3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS)是已知唯一有活性的硫酸基团供体，是生物“活化”的硫酸盐形式，是细胞对无机硫酸盐的吸收和代谢至关重要的物质。此外，已证实多种疾病的产生与发展会引起组织中PAPS含量的改变，如癌症、HIV等。

PAPS是硫酸软骨素、肝素和硫酸皮肤素等最直接的硫酸根供体。目前PAPS的主要来源为提取法和酶法合成。由于PAPS在大多数生物体内直接含量少，使得提取PAPS工艺繁琐，且副产物较多难以纯化，直接导致PAPS的生产成本高昂。

酶法合成PAPS以腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)和硫酸根为底物，经ATP硫酸化酶和APS激酶催化合成PAPS。在反应的第一步由ATP硫酸化酶生成腺苷磷酰硫酸(Adenosine phosphosulfate，APS)和副产物焦磷酸，第二步反应APS经由APS激酶催化合成目的产物PAPS和副产腺苷二磷酸(Adenosine diphosphate，ADP)。由于必然产生的副产物ADP，酶法合成PAPS的底物ATP理论转化率为50％。在高等生物，如哺乳动物、海底蠕虫等生物中，PAPS合成酶为双功能酶，使得硫代谢更加多功能高效率。

由于目前PAPS的纯化处起步阶段，所得PAPS纯度有限，直接导致纯度较高的PAPS价格昂贵且限制了其应用。

发明内容

[技术问题]

目前体外酶法合成PAPS主要为双酶一锅法，存在效率与转化率低，成本高等缺点，不利于规模化生产。

[技术方案]

本发明提供一种基于构建双功能酶合成PAPS的方法，是模仿高等生物生产PAPS的方式，也体现了高等生物体的一种进化趋势，利用不同的接头序列将ATP硫酸化酶和APS激酶融合成一个双功能蛋白，实现人工PAPS合成双功能酶的构建。这种将不稳定的中间体导入双功能酶反应中的机制，极大的提高了底物ATP的转化率和转化效率。且在实际生产中也简化了多酶制备的步骤，降低生产成本。并通过突变ATP硫酸化酶保守区域P环HRAH序列为HNGH和HKGH，进一步提高其催化活力。

本发明提供了一种合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸的方法，利用PAPS合成双功能酶，以ATP为底物，合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸。

在本发明的一种实施方式中，所述PAPS合成双功能酶是将ATP硫酸化酶和APS激酶通过融合接头序列连接，得到ATP硫酸化酶和APS激酶的融合蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列如SEQ ID NO:1～5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述融合接头序列可以重复多次，重复次数不超过6次。

在本发明的一种实施方式中，所述ATP硫酸化酶来源于乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母或产黄青霉菌。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于乳酸克鲁维酵母的ATP硫酸化酶Gene ID为2894185；