[发明专利]一种猪流感病毒的检测引物及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种猪流感病毒的检测引物，属于基因检测技术领域，所述检测引物包括扩增猪流感病毒基因的正向引物、反向引物及探针引物，本发明采用数字PCR技术检测猪流感病毒，设计的引物和探针可以扩展适用于其它数字PCR系统；可检测出低浓度的猪流感病毒核酸样本，具有很高的特异性及灵敏度，引物扩增效率高，将极大地提高猪流感病毒的检出率，为临床检测猪流感病毒提供一种可靠方法。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及数字PCR检测猪流感病毒的引物及其试剂盒。

背景技术

猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的猪急性呼吸道传染病，不仅给养猪业带来了极大的危害，还严重危害人类健康，因此引起全球公共卫生的关注。猪流感病毒(SIV)感染可引起以呼吸道疾病为特征的呼吸道疾病如咳嗽，打喷嚏，流鼻涕，直肠温度升高，昏昏欲睡，呼吸困难和食欲降低。该病毒对热、消毒剂敏感，而对干燥和低温的抵抗力强大。猪流感病毒能够在多种动物的细胞上增殖，但病毒分离和疫苗生产时，经常采用鸡胚接种。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力很大，因此病毒的变异频繁，其机理涉及分子水平的抗原漂移和抗原转变。

猪流感病毒属于正黏病毒科甲型流感病毒属，病毒粒子多形态。基因组包含八个分节段的负链RNA，至少编码12～13种蛋白。根据病毒表面糖蛋白的不同，甲型流感病毒可以分为 16种HA亚型(H1～H16)以及9种NA亚型(N1～N9)。甲型流感病毒可感染多种宿主，包括禽、猪、以及人等。由于猪的呼吸道上皮细胞中同时具有与禽流感病毒和人流感病毒结合的受体，因此人流感病毒和禽流感病毒均可感染猪。同样，越来越多的报道表明，SIV也可以反传给禽和人。自1974年起，全球常有SIV感染人的报道，并导致部分病例死亡。更为重要的是1957 年、1968年以及2009年的流感大流行毒株均推测与猪流感病毒有关。2011年8月起，倍受全球关注的猪流感三源重配H3N2/H1N2亚型变异株在美国13个地区造成318人感染，其中1 人死亡，16人住院治疗。

近些年，荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction，QPCR)是检测定量猪流感病毒常使用的技术手段，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光标记的探针(如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，以此来评估PCR的扩增效果。荧光定量PCR主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。该技术存在众多不足：1.校准品和样品间背景的差异易影响PCR的效率和测量响应；2.低拷贝数的目标核酸分子不能通过扩增检测到；3.样品的PCR扩增效率可能与校准物的扩增效率不同；4.RNA提取时引入RNA溶液的杂质或者 RNA降解影响了PCR动态扩增过程。因此，荧光定量PCR很难达到对低拷贝值猪流感病毒的检测与绝对定量。

数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是一项针对单分子靶标核酸绝对定量的新技术。该技术是将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室(如芯片)，液体分子遵从泊松分布，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，这种样品的分配可以极大降低本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，最后分析每个扩增产物，通过泊松概率分布公式计算出DNA模板的原始拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。极大提高了检出率，假阴性检出水平(单DNA模板出现在反应室而未被检出)非常低。其具有操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点。

数字PCR作为核酸定量的新技术，克服了实时荧光定量PCR的一系列缺点，实现了单个核酸分子的绝对定量。避免了荧光定量PCR使用标准曲线对测量结果产生影响等问题。此技术可代替荧光定量PCR应用于猪流感病毒的定量检测。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一组特异性强，扩增效率高的PCR引物及探针，再结合高灵敏度的数字PCR技术，以达到检测和绝对定量低拷贝值猪流感病毒的目的。