[发明专利]肺癌组织中PD-L1蛋白的检测方法

权利要求书

1.肺癌组织中PD-L1蛋白的检测方法，其特征在于：采用热变性介导的去糖基化方法对PD-L1去糖基化处理后，再利用免疫组织化学检测方法检测PD-L1蛋白表达状态。

2.根据权利要求1所述的肺癌组织中PD-L1蛋白的检测方法，其特征在于：所述PD-L1检测抗体包括PD-L1 28-8、PD-L1 CAL10、PD-L1 SP142。

3.肺癌组织中PD-L1蛋白的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)IHC预处理：将肺癌组织切片脱蜡、水合，具体步骤为：将切片用二甲苯浸泡，更换二甲苯后再浸泡，再依次在无水乙醇中浸泡、95％乙醇中浸泡、85％乙醇中浸泡、70％乙醇中浸泡；PBS浸洗；

(2)灭活酶：在预处理后的切片上滴加3％H₂O₂-甲醇溶液，室温封闭；

(3)抗原修复：将放有灭活后的切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的染色盒内，置于微波炉中加热；将染色盒取出浸入流水中，自然冷却；PBS浸洗；

(4)去糖基化：将抗原修复后的切片用1×糖蛋白变性缓冲液孵育，孵育后置于冰上降温；再用配置的去糖基化试剂进行去糖基化处理；PBS浸洗；

(5)封闭及抗原-抗体反应:在去糖基化的切片上滴加1％BSA,室温孵育；甩去表面液体；再滴加稀释后的一抗，4℃过夜；PBS浸洗；

(6)一抗二抗反应：在步骤(5)反应后的切片上滴加稀释后的二抗，室温湿盒孵育；PBS浸洗；

(7)显色与终止显色：在步骤(6)反应后的切片上加新鲜配制的DAB溶液；镜下观察染色深浅，染好立即终止，用自来水轻柔冲洗，再用蒸馏水终止显色反应；

(8)苏木素复染：将步骤(7)显色后的切片放入苏木素染液，染色，用蒸馏水冲洗干净；

(9)脱水封片：将步骤(8)复染后的切片依次在70％乙醇中浸泡、85％乙醇中浸泡、95％乙醇中浸泡、无水乙醇乙醇中浸泡；再用二甲苯浸泡，更换二甲苯后再浸泡；在切片上加中性树胶，加盖玻片；

(10)拍照及分析：采用Aperio Digital Pathology Slide Scanners设备扫描步骤(9)封片后的切片，并采用HALO数字病理评分系统对各切片进行分析。

4.根据权利要求3所述的肺癌组织中PD-L1蛋白的检测方法，其特征在于：所述去糖基化酶试剂配方为：60μl 10X GlycoBuffer 2(P0708,New England Biolabs),60μl 10％NP40(P0708,New England Biolabs),180μl H₂O,15μl重组PNGase F(P0708,New EnglandBiolabs)。