[发明专利]FRT细胞株在制备筛选Chrm3调节剂的制剂或试剂盒中的应用

说明书

本发明涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株在制备筛选Chrm3调节剂的制剂或试剂盒中的应用。FRT细胞在mRNA及蛋白水平均内源性表达Chrm3；成功构建了稳定共表达ANO1和YFP‑H148Q/I152L的FRT细胞模型；该细胞模型可敏感检测细胞内钙浓度，荧光变化的斜率值与Chrm3调节剂浓度成剂量依赖关系，可用于Chrm3调节剂的筛选；该模型的Z＇因子值为0.678，满足高通量筛选的要求。此细胞模型通过敏感检测钙信号实现了对Chrm3调节剂的高通量筛选，也可应用于对其他与钙离子信号相关GPCR靶点的筛选。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株在制备筛选Chrm3调节剂的制剂或试剂盒中的应用。

背景技术

毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic receptor，mAChR)是指能与毒蕈碱(muscarine)特异性结合并被激动的胆碱受体。mAChR是G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor，GPCR)家族的一个成员，分为五种不同的亚型Chrm1～Chrm5。毒蕈碱型乙酰胆碱受体Ⅲ亚型(Chrm3)主要分布于外分泌腺、平滑肌、血管内皮、脑和自主神经节等，介导了许多重要的生理功能，如：血管平滑肌舒张、胃肠道和膀胱平滑肌收缩、括约肌松弛、瞳孔缩小、腺体分泌增加等。Chrm3的激活剂和拮抗剂产生着不同的效应在临床上可以治疗多种疾病。其中，Chrm3的激活剂对干燥综合征的治疗具有良好的作用，已成为新一代改善眼干、口干的药物；通过激活Chrm3可显著抑制心脏成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌，对心肌起到保护作用。而其拮抗剂不但可以治疗膀胱过度活动症、呼吸道疾病、慢性阻塞性肺疾病、肠易激综合征等，还可以抑制结肠癌的发生、抑制胆管癌对神经周围的侵袭和转移。临床采用的Chrm3激活剂或拮抗剂通常为mAChR的激活剂和拮抗剂，治疗某些疾病可获得一定的疗效，由于其特异性不强，都伴有不同程度的副作用，比如，临床治疗膀胱过度活动症时，采用索非那新引起膀胱收缩，但会产生口干、视觉模糊的副作用，阿托品治疗胃肠平滑肌的痉挛时，往往带来便秘、出汗减少、排尿困难的副作用。由于Chrm3分布较广，往往与mAChR其他亚型共存，目前尚无高选择性、高活性的Chrm3调节剂。Chrm3作为一个治疗多种重大疾病药物治疗靶点，虽然已有其调节剂相关药物上市，但仍存在组织选择性不高，对其他亚型也有较强抑制性的缺点。因此，开发靶向Chrm3药物治疗相关疾病具有重大的临床意义，类似的高选择性和高活性的天然小分子GRCR激活剂和抑制剂也已成为当今研究的热点。

研发高选择性和高活性的天然小分子GPCR激活剂和抑制剂一直是科研领域的研究热点。通常筛选GPCR调节剂的方法有钙流检测、cAMP检测、报告基因检测等。钙流检测通常采用荧光染料，如Flou-3、Flou-4等，利用荧光染料与Ca²⁺结合后产生较强的荧光信号，对钙浓度的变化进行实时监测，其缺点是操作繁琐，试剂耗费高，周期长，易受其他二价阳离子的干扰。

发明内容

有鉴于此，本发明建立了一种基于CaCC靶向Chrm3的高效敏感的高通量细胞筛选模型和方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了FRT细胞株在制备筛选Chrm3调节剂的制剂或试剂盒中的应用；所述FRT细胞株中ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达；

所述FRT细胞株通过荧光信号反应细胞内Ca²⁺浓度的变化进而筛选Chrm3调节剂；

所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与Chrm3调节剂浓度成剂量依赖关系；

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca²⁺浓度呈现良好的正相关；

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：