[发明专利]用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及方法，所述用于2019新型冠状病毒检测的引物组包括用于等温扩增检测的外引物对、内引物对和环引物对，外引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，内引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，环引物对的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。本发明提供的新型冠状病毒恒温显色扩增内外环引物组，以的恒温显色筛查检测方法，检测方法特异性强，灵敏度高，仅使用廉价、便捷的恒温水浴锅即可获得检测结果，是对新型冠状病毒检测S基因方法和试剂盒的有力补充。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于2019新型冠状病毒检测的引物组、恒温显色筛查试剂盒及检测方法。

背景技术

目前新型冠状病毒核酸检测试剂不仅短缺，而且存在着检出率不高，经常出现假阴性的问题；而且受PCR实验环境设施的严格要求，具有检测资质的实验室数量有限。这些都在影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。

2019年新型冠状病毒(2019-nCoV)是一种单链RNA冠状病毒，基因组序列由29903bp构成，该基因组拥有10个基因，可以有效编码10个蛋白。它可引起呼吸道感染，目前WHO已统一命名为“新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia，NCP)”。由于疫情发展迅速，及时对不同程度临床症状病人及疑似患者进行诊断需要快速有效的方法，新冠病毒RNA检测可为诊断提供直接证据，在目前最新版本(新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版))的诊疗方案中，新冠病毒核酸的检出仍是唯一确诊依据。从技术的角度看，在灵敏度和特异性的平衡上，相比较一些快速检测方法，目前平衡的最好的仍是实时荧光PCR(RT-PCR)检测技术。从过往的重大疫情来看，无论是西非埃博拉病毒、甲流还是中东呼吸综合征，RT-PCR仍是国家首推的检测手段。

基于病毒基因保守序列的RT-PCR检测方法，是呼吸道病毒检测的常用方法，本次疫情的新冠病毒检测也同样适用。该方法通过对病毒RNA进行提取、逆转录、PCR扩增病毒保守序列(RdRP基因(特异性靶点)、E蛋白基因、N蛋白基因以及一个鉴定保守基因S蛋白基因区位点；可以只检测RdRP基因或者选择RdRP基因和其他多个基因确认)，扩增体系中的荧光蛋白会结合扩增出的双链DNA序列从而发出荧光，根据检测到的荧光值判断是否有病毒存在并定量。

WHO推荐的6套检测靶点病毒保守序列有ORF1a基因、ORF1ab基因(特异性靶点RdRP)、S基因、E基因、M基因、N基因。目前，中国检测ORF1ab和N基因；德国检测RdRP、E基因、N基因；中国香港检测ORF1b-nsp14、N基因；日本检测筛查冠状病毒多基因、S基因；泰国检测N基因；美国检测N基因、PdRP。目前仅以ORF1ab和N基因作为检测靶标存在着一定的漏检风险。

现行的新型冠状病毒检测方法都存在一定的问题，影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。检测病毒抗体和血清学方法简单快速，但特异性差，灵敏度低，假阴性高，而且短期内很难获得病毒高质量特异性抗体，导致免疫学检测受到限制。病毒基因组测序检测时间长，对检测机构的技术能力和仪器条件要求比较高，导致病毒基因组测序技术不能大范围的推广应用，不能满足疫情实时检测的需要。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低；基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，为全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在基层检测部门和防疫机构普及，并且要保证高特异性需要荧光标记探针，检测成本较高。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足疫情期间病毒快速检测的需要。

对于目前新型冠状病毒检测技术存在的问题主要在于：