[发明专利]一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、分别构建ANO1和YFP-H148Q/I152L的真核表达载体；

步骤二、将所述真核表达载体分别稳定转染入FRT细胞中，且使所述FRT细胞共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L两种蛋白后，经过多次有限稀释，获取FRT细胞克隆模型；

步骤三、将所述FRT细胞克隆模型传代到黑壁透明底的微孔板中，且使细胞密度为每孔20000个细胞，48h后细胞汇合度达到90％以上；

步骤四、向所述黑壁微孔板中分别加入待测试化合物和碘化钠PBS后测试所述YFP-H148Q/I152L荧光蛋白的相对荧光强度，当所述相对荧光强度迅速下降时，所述待测试化合物为钙激活氯离子通道激活剂；

其中，在所述步骤四中，每孔逐个测试所述YFP-H148Q/I152L荧光蛋白的相对荧光强度，且测试总时间不超过5分钟，每孔检测时间为5s。

2.根据权利要求1所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述待测试化合物的终浓度为100～1000μmol/L。

3.根据权利要求1所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述待测试化合物均包括高浓度待测试化合物和适宜浓度待测试化合物；其中，所述适宜浓度待测试化合物为所述高浓度化合物倍比稀释得到；以及

还包括：

步骤五、通过步骤四检测出待测化合物为钙激活氯离子通过到激活剂后，对所述待测试化合物进行继续每孔逐个测试所述YFP-H148Q/I152L荧光蛋白的相对荧光强度：

当所述适宜浓度待测试化合物的所述相对荧光强度继续显著下降时，所述待测试化合物为直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂；

当所述适宜浓度待测试化合物的所述相对荧光强度先下降后保持不变时，所述待测试化合物为非直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂。

4.根据权利要求3所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述高浓度待测试化合物的终浓度为100～1000μmol/L。

5.根据权利要求3所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，所述适宜浓度待测试化合物的终浓度为10～100μmol/L。

6.根据权利要求2所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，在所述步骤四中，通过由内面向外膜片钳试验或者全细胞膜片钳试验验证测试结果。

7.根据权利要求3所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，其特征在于，在所述步骤五中，通过由内面向外膜片钳试验或者全细胞膜片钳试验验证测试结果。

8.一种制备钙激活氯离子通道激活剂的应用，其特征在于，使用如权利要求1-7中任一项所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法进行制备，所述钙激活氯离子通道激活剂为ATP、carbachol、ionomycin、calcimycin和N-aroylaminothiazole。

9.一种制备直接作用于钙激活氯离子通道激活剂的应用，其特征在于，使用如权利要求3-7中任一项所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法进行制备，所述直接作用于钙激活氯离子通道激活剂为N-aroylaminothiazole。

10.一种制备非直接作用于钙激活氯离子通道激活剂的应用，其特征在于，使用如权利要求3-7中任一项所述的钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法进行制备，所述非直接作用于钙激活氯离子通道激活剂为ATP、carbachol、ionomycin和calcimycin。