[发明专利]一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，包括：分别构建ANO1和YFP‑H148Q/I152L的真核表达载体；将所述真核表达载体分别稳定转染入FRT细胞中，且使所述FRT细胞共表达ANO1和YFP‑H148Q/I152L两种蛋白后，经过多次有限稀释，获取FRT细胞克隆模型；将所述FRT细胞克隆模型传代到黑壁透明底的微孔板中，且使细胞密度为每孔20000个细胞，48h后细胞汇合度达到90％以上；向所述黑壁微孔板中分别加入待测试化合物和碘化钠PBS后测试所述YFP‑H148Q/I152L荧光蛋白的相对荧光强度，当所述相对荧光强度迅速下降时，所述待测试化合物为钙激活氯离子通道激活剂，持续检测相对荧光强度一直保持下降为直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂。

技术领域

本发明涉及钙激活氯离子通道激活剂技术领域，尤其涉及一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法及应用。

背景技术

钙激活氯离子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)在生理情况下被细胞内钙离子激活，并可转运体内含量最丰富的氯离子，CaCCs表达于血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌、心肌细胞、心脏成纤维细胞、上皮细胞、某些特定的肿瘤细胞等。在跨上皮细胞液体转运、平滑肌细胞收缩、感觉传导、神经和心脏兴奋性等生理活动中扮演者重要角色，与恶性肿瘤、高血压、胃肠道运动紊乱、囊性纤维化和疼痛等许多疾病的发生密切相关。2008年三个独立实验室发现Anocatmin1(ANO1)是CaCCs的编码基因，从而拉开了深入研究CaCCs的序幕。目前比较公认的是，ANO1激活剂可以用于治疗囊性纤维化、口干、眼干综合征和胃肠道动力障碍等CaCCs相关疾病的治疗。

目前ANO1激活剂的筛选首先通过细胞模型进行初筛，检测ANO1是否开放或者激活主要通过卤族元素敏感的荧光染料或者荧光蛋白，因为荧光染料方法操作步骤繁琐、价格昂贵且重复性不佳，目前更多倾向于使用卤族元素敏感的荧光蛋白。在获得初筛的阳性结果后，通过电生理技术如膜片钳即研究离子通道的金标准进行确证实验。申请号为201410078438.1的发明专利中公开了筛选钙激活氯离子通道抑制剂的细胞模型和方法，通过该模型进行ANO1激活剂的筛选时，由于研究者在筛选ANO1激活剂时，忽视了ANO1的生理特性如在不同情况下的开放时间，特别是在ANO1被高浓度激活剂激活时开放时间明显缩短且电流大小明显降低的现象，从而在筛选中一直未能很好的发现真正的ANO1激活剂，对于ANO1激活剂的更具体的筛选也一直未能很好的实现。

电生理技术如膜片钳是筛选离子通道调节剂的金标准，但目前电生理技术还不能实现短时间内大量筛选调节剂的工作，此外，还有机器昂贵、操作繁琐且难度较大等缺点。为了在短时间内筛选大量小分子化合物，研究者往往选取细胞模型就行高通量筛选。在此过程中往往选取96甚至384孔板同时筛选多种化合物，且每个孔或者说每个化合物筛选时间大约15秒，如果以96孔板为例，筛选到最后一个化合物已经将近25分钟，如果应用384孔板时间会更长，因此，这也造成了在筛选中未能发现真正的ANO1激活剂，出现了假阴性的结果。

发明内容

本发明设计开发了一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，本发明的发明目的之一是能够高效筛选钙激活氯离子通道激活剂，且解决了由于钙激活氯离子通道在高浓度激活剂的状态下开放随时间明显减弱甚至检测不出的问题，同时，当筛选时间超过5分钟时，出现漏筛或者假阳性的测试结果进而导致筛选不准确的问题。

本发明的发明目的之二是通过对高浓度激活剂倍比稀释后持续测试，能够筛选出直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂和非直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂的问题。

本发明还设计开发了制备钙激活氯离子通道激活剂的应用，用于制备直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂和非直接作用于钙激活氯离子通道的激活剂。

本发明提供的技术方案为：

一种钙激活氯离子通道激活剂的筛选方法，包括如下步骤：