[发明专利]一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用。本发明提供的氟尼辛人工抗原为式Ⅰ所示化合物，其中K表示载体蛋白。使用本发明提供的人工抗原免疫动物，可制备得到高灵敏度的特异性抗体，方法简便、易行。将本发明提供的人工抗原及其制备的抗体应用到兽药残留检测中，可实现在痕量水平上对氟尼辛进行快速高通量检测。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体而言，涉及一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

氟尼辛(Flunixin，简称FLU)是一种动物专用的非甾体类抗炎药物，常与稳定剂葡甲胺(Meglumine)以等比例形式出现形成稳定的氟尼辛葡甲胺盐(Flunixin Meglumine，简称FM)。其药理作用机制主要是通过抑制环氧化酶来减少前列腺素等炎性介质的生成而发挥解热、镇痛和抗炎作用。临床上常用于各种疾病感染导致的猪、牛、马等大型动物的急性炎症；另外，其与抗生素联合用药，具有显著的药物协同作用，能够有效改善疾病的临床症状。自20世纪90年代研制成功以来，氟尼辛葡甲胺已在包括中国在内的多个国家得到广泛应用，并成为国内外兽医临床使用量最大的非甾体类抗炎药物。

为加强对动物性食品中氟尼辛的残留监管，保证动物产品质量安全，欧盟委员会规定氟尼辛在牛肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中的最大残留限量分别为20、30、300和100μg/kg；美国FDA规定了氟尼辛在猪肌肉和肝脏组织中的最大残留限量分别为25和30μg/kg。

目前，我国行业标准中对动物源性食品中氟尼辛的残留检测主要采用液相色谱-质谱/质谱法。此方法虽然特异性强、灵敏度高，但是样品前处理复杂繁琐，检测时间长，成本也较高，推广使用受到限制。免疫分析方法是一种基于抗原与抗体特异性反应的定性定量分析方法，该方法特异性强、灵敏度高，反应快速，操作简单，适合现场大量样本的实时检测。

在涉及到氟尼辛人工抗原和抗体制备的有限研究中，Lin等人使用氟尼辛葡甲胺这种混合物作为半抗原与载体蛋白进行偶联制备氟尼辛的人工抗原。这种方法制备得到的人工抗原在制备与应用过程中，无法进行精确表征，难以进行质量控制，不利于方法的推广应用。Lin L,Jiang W,Xu L,et al.Development of IC-ELISA andimmunochromatographic strip assay for the detection of flunixin meglumine inmilk[J].FoodAgricultural Immunology,2017:1-11。

Chen等人使用氟尼辛的代谢物5-羟基氟尼辛与载体蛋白偶联进行氟尼辛人工抗原的制备，该方法制备获得的抗体可较好的识别5-羟基氟尼辛，但对氟尼辛的灵敏度较差，IC₅₀为1.43ng/mL。Chen等人也尝试了使用氟尼辛作为半抗原与载体蛋白偶联制备氟尼辛人工抗原，但免疫效果比使用5-羟基氟尼辛更差，因此最终选择了5-羟基氟尼辛与载体蛋白偶联作为氟尼辛的人工抗原。Chen X,Peng S,Liu C,et al.Development of an indirectcompetitive enzyme-linked immunosorbent assay for detecting flunixin and 5-hydroxyflunixin residues in bovine muscle and milk[J].FoodAgriculturalImmunology,2019,30(1):320-332。

发明内容

为解决现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种具有强免疫效果的氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供氟尼辛人工抗原，其结构如式Ⅰ所示。

式Ⅰ中，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清白蛋白或血蓝蛋白，优选牛血清白蛋白和血蓝蛋白。其中，式Ⅰ中的K为血蓝蛋白时，作为免疫原；K为牛血清白蛋白时，作为包被原。