[发明专利]AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及植物细胞技术领域，具体公开了AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途，所述AOX特异性抗体组合包含AOX1a、AOX1b/c、AOX1d和AOX2四个抗体。本发明获得的AOX特异性抗体组合灵敏度很高，四个AOX特异性抗体能够分别检测植物中蛋白序列高度相似的AOX蛋白。

技术领域

本发明涉及植物细胞技术领域，具体涉及AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途。

背景技术

光合作用是地球能量的主要来源，对光合作用的研究有助于提高农作物产量，也可能对能源短缺问题提供新的解决思路。植物光合作用涉及电子传递链，而AOX蛋白是交替氧化酶电子传递途径的末端氧化酶，参与抗氰呼吸，在植物抵抗逆境胁迫过程中发挥着非常重要的作用，因此成为研究的热点。

植物的线粒体中有五个AOX蛋白：AOX1a，AOX1b，AOX1c，AOX1d和AOX2。它们具有同源性，蛋白相似度很高。目前的研究集中在AOX1a，其他四个报道很少，AOX1a是主要的，相对来说表达量较大，另外四个则很难检测，一般用的抗体都来自于UNIVERSITY OF NEBRASKA,LINCOHN，这是一个单克隆抗体，专一性很好，但这个抗体灵敏度很低，连AOX1a都难以检测。

在检测AOX表达的蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)中，首先要先提取细胞的膜蛋白，再用1:50的稀释倍数的AOX抗体，才可以用Western Blot来显示AOX1a，由于其他四个AOX的丰度要远远小于AOX1a，要检测它们在植物中的水平就非常困难，并且这个抗体不能区分具体是哪种亚型的AOX，检测到的是AOX家族的全体。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了AOX特异性抗体组合及其制备方法和用途，实现了高效检测植物中所有的交替氧化酶，为涉及该蛋白领域的研究提供了有效的检测工具。

本发明第一个目的是提供了AOX特异性抗体组合，所述AOX特异性抗体包含AOX1a、AOX1b/c、AOX1d和AOX2四个抗体；

所述抗体AOX1a对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；

所述抗体AOX1b/c对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；

所述抗体AOX1d对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；

所述抗体AOX2对应抗原的基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。

本发明还提供了上述AOX特异性抗体组合的制备方法，包括如下步骤：

S1，目的基因序列的合成，所述目的基因分别为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4：

S2，将S1合成的目的基因SEQ ID NO.1通过EcoRI和XhoI双酶切连接构建到大肠杆菌表达载体pGEX4T.3载体上，然后通过在大肠杆菌中诱导蛋白表达，获得AOX与GST的融合蛋白，标记为GST-AOX1a；

S3，将S2获得的GST-AOX1a蛋白进行提纯：

S4，将S3中提纯的蛋白注射到兔子体内，进行4次免疫后，分离血清，获得AOX特异性抗体AOX1a；

S5，分别合成目的基因SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4，然后参照S2-S4的方法制备相应的AOX特异性抗体AOX1b/c，AOX1d，AOX2。

本发明的第三个目的是提供所述AOX特异性抗体组合在检测植物交替氧化酶中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：