[发明专利]一种猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用

说明书

本发明属于药物靶标筛选领域，具体涉及一种猪链球菌c‑di‑AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用。基于化学发光方法，根据反应体系中相对发光值大小反映DacA酶活性。反应体系是由猪链球菌SC19 c‑di‑AMP合成酶功能结构域DacA(99‑283)、ATP、酶活反应缓冲液和Reagent组成。根据高通量筛选判定标准，计算了化学发光法的Z值、信号与背景的比值以及阴、阳试验组信号值的变异系数平均值，本发明符合高通量筛选标准。利用本发明的对药库的筛选鉴定出1种化合物即抑制剂IPA‑3对猪链球菌c‑di‑AMP合成酶有抑制作用以及猪链球菌革兰氏阳性细菌具有抑制作用。

技术领域

本发明属于药物靶标筛选技术领域，具体涉及一种猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用。本发明涉及一种猪链球菌c-di-AMP合成酶，尤其是涉及一种c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用。

背景技术

在革兰氏阳性细菌中存在一种第二信使分子c-di-AMP，它是由c-di-AMP合成酶(DacA)催化两个ATP分子合成,同时生成两个PPi分子,而革兰氏阴性菌缺乏DacA同源蛋白和c-di-AMP。c-di-AMP在多种革兰氏阳性细菌中是必要的，其通过与效应蛋白或核糖体开关结合调控了细菌的钾离子运输、渗透压稳态和细胞壁平衡等生理生化过程(Fahmi T,Port GC,Cho KH.c-di-AMP:An Essential Molecule in the Signaling Pathways thatRegulate the Viability and Virulence of Gram-Positive Bacteria.Genes(Basel).2017；8(8):197.)。在多种革兰氏阳性细菌中DacA是致死基因,革兰氏阳性细菌猪链球菌(Streptococcus suis)该基因不能被缺失，因此其是一种潜在的抗猪链球菌甚至是抗革兰氏阳性菌药物靶标。故以该种蛋白为靶标进行药物筛选是非常值得研究的课题。

现有靶向DacA的药物筛选方法是利用c-di-AMP与甲氧檗因(coralyne)聚合能保护后者的荧光不被卤化物如碘甲胆碱淬灭，从而通过测量反应体系中的荧光值间接反映生成的c-di-AMP的量，进而判断药物小分子对蛋白活性的抑制效率。但是根据文献，很多小分子能够直接淬灭甲氧檗因(coralyne)的荧光，所以会导致假阳性偏高(Zheng Y,Zhou J,Sayre D A,et al.Identification of bromophenol thiohydantoin as an inhibitorof DisA,a c-di-AMP synthase,from a 1000compound library,using the coralyneassay[J].Chemical Communications,2014,50(76):11234-11237.)。

截至目前，尚未发现美国FDA批准上市的靶向DacA的抗菌杀菌药物。

目前有关c-di-MP合成酶活性的测定方法有一下几种：

第二信使c-di-MP合成酶活性测定反应中的三个基本组分为：c-di-MP合成酶、ATP、c-di-AMP,c-di-MP合成酶活性测定的核心问题是测定一定条件下，有多少ATP转化为c-di-AMP。

有关放射性同位素检测法：即在反应体系中加入一定量的α-³²P-ATP，然后通过检测α-³²P-c-di-AMP的量来检测c-di-MP合成酶活性(Opoku-Temeng C,Sintim H O.Potentinhibition of cyclic diadenylate monophosphate cyclase by the antiparasiticdrug,suramin[J].Chem Commun,2016,52(19):10.1039.C5CC10446G.)。