[发明专利]共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用

说明书

本发明提供了共表达分泌型IL‑7和选择性CCL19的表达载体及其应用，所述表达载体包括IL‑6信号肽编码基因、IL‑7编码基因、NFAT调控型启动子和CCL19编码基因。本发明的表达载体中，在IL‑7编码基因的上游添加IL‑6信号肽的编码基因，实现了T细胞对IL‑7的分泌性表达；采用NFAT调控型启动子作为CCL19编码基因的启动子，实现了T细胞对CCL19的选择性表达，含有所述表达载体的CAR‑T细胞的增殖能力和肿瘤细胞杀伤效率均得到显著提高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方法，通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。

近年来，CAR-T疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得令人瞩目的成果，美国FDA已经批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞产品上市，国内也有多家公司针对CD19的靶点开展了临床试验。但是，CAR-T细胞治疗实体瘤效果不佳，主要原因是缺乏合适的靶抗原，CAR-T细胞在体内持续时间短，存在免疫逃逸、免疫抑制肿瘤微环境等问题。

现有技术CN107109421A、CN109153989A将编码IL-7和CCL19的核酸序列由编码自切割肽的序列连接，构建的CAR-T细胞持续分泌IL-7和CCL19，不仅提高了CAR-T细胞的体外扩增能力，而且招募到更多的外周血循环T细胞和树突状细胞，增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率，不能实现将外周血免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部的效果。此外，IL-7蛋白分泌到胞外受到T细胞的严格控制，存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外的问题。

因此，有必要对现有技术进行改进，使得CAR-T细胞不仅能将IL-7分泌到T细胞外，而且使CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体及其应用，含有所述表达载体的CAR-T细胞不仅能将IL-7分泌到T细胞外，而且使CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，进一步提高了CAR-T的肿瘤杀伤能力。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种共表达分泌型IL-7和选择性CCL19的表达载体，所述表达载体包括IL-6信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控型启动子和CCL19编码基因。

本发明中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-6的信号肽，在IL-7编码基因的上游添加IL-6信号肽的编码基因，实现了T细胞对IL-7的分泌性表达；采用NFAT调控型启动子作为CCL19编码基因的启动子，实现了T细胞对CCL19的选择性表达。

优选地，所述IL-6信号肽编码基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

SEQ ID NO:1：

atgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctggggctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgcccca。

优选地，所述IL-7编码基因包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；

SEQ ID NO:2：