[发明专利]一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)对病原微生物感染的样本中的DNA和RNA分别进行提取，并对所述RNA进行富集，而后混合所得DNA和RNA得到总核酸，作为待测样本；

或者，直接提取微生物感染的样本中的总核酸作为待测样本；

(2)所述待测样本中含有病原微生物的DNA和RNA，而后对所述待测样本中的RNA进行片段化，同时进行一链cDNA合成；

(3)所述一链cDNA合成结束后，再进行二链cDNA合成得到cDNA/DNA复合物；

(4)使用片段化酶将所述cDNA/DNA复合物打断，并进行末端修复和加尾反应、接头连接、PCR富集和纯化，得到基于总核酸构建的测序文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述病原微生物包括细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、衣原体、支原体或寄生虫中任意一种或至少两种的组合；

步骤(1)所述病原微生物感染的样本包括肺泡灌洗液、痰液、脑脊液、胸腔积液或穿刺组织中的任意一种或至少两种的组合；

步骤(1)中直接提取脑脊液和/或穿刺组织中的总核酸作为待测样本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述富集的反应体系中包括Turbo脱氧核糖核酸酶和/或Baseline脱氧核糖核酸酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系中包含样本中的DNA、RNA、逆转录酶、RNA片段化酶和dNTPs；

所述逆转录酶与RNA片段化酶的体积比为1:(5～8)；

所述一链cDNA合成的反应条件为：

先在20～30℃下反应5～10min，而后在40～42℃下反应10～15min，再于65～70℃下反应10～20min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的反应体系中包含样本中的DNA、一链cDNA、DNA聚合酶和无核酶水；

所述二链cDNA合成的反应条件为：

先在20～30℃下反应20～40min，而后在60～65℃下反应10～15min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述末端修复和加尾反应的反应体系中包括：DNA片段化酶及对应预混缓冲液、末端修复-加A尾酶及对应预混缓冲液、DNA片段化-加A尾酶增强子及增强预混缓冲液；

步骤(4)所述接头连接的反应温度为22～26℃，反应时间为10～15min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述接头连接的反应体系中，片段化的DNA与接头的使用量比值为(15～20)ng:1μL；

步骤(4)所述测序文库的浓度≥2.0ng/μL；

步骤(4)所述测序文库中DNA片段的长度为220bp～400bp。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中纯化核酸使用的方法为磁珠纯化法；

所述方法还包括将所述测序文库进行高通量测序和生物信息学分析的步骤。