[发明专利]一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法及试剂盒。所述方法中包括对病原微生物总核酸的提取，简化了DNA和RNA分别独立检测的流程，并对所得总核酸中的RNA进行富集，而后进行一链cDNA合成、二链cDNA合成、末端修复、加尾反应和接头连接等步骤，得到感染样本中病原微生物的测序文库。所述方法实现了在单管反应内同时检测DNA和RNA病原体，且能够覆盖多达13396个病原体，在降低检测成本和减少检测步骤的基础上，显著提高了细菌、真菌、病毒等复合感染的致病菌检出率。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种构建病原微生物的测序文库的方法，尤其涉及一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法。

背景技术

感染性疾病是临床常见疾病之一，多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。

在感染性疾病领域中已有多种方式检测病原微生物。其中，(1)获得病原体的活体是感染性疾病诊断的金标准，对于细菌、真菌、病毒而言，主要是培养阳性，但病原体的体外培养耗时普遍较长，操作步骤繁琐，且绝大多数病原体不可培养；(2)利用免疫学方法，如补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附实验、免疫荧光法和酶标斑点免疫法等检测病原微生物，虽然操作较为简单，但由于病原体种类繁多，已研发的抗原、抗体数量远远不能满足市场需求；(3)PCR检测病原微生物具有极高的灵敏度和特异性，但无法完成高通量筛查，检出率较低；(4)基因芯片技术只能对已知的病原体基因组进行意向性筛查，而无法检测新的未知病原体。

然而，上述传统检测方法仍然存在无法快速准确地确定病原体信息等问题，容易导致感染性疾病患者不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。因此，快速、特异且高通量的病原体检测方法，对有效诊断和及时防治感染性疾病具有重要的意义。

基于宏基因组学测序(mNGS)的病原学诊断技术是一种非靶向的广谱病原学筛查技术，近几年越来越多的研究表明其在重症感染领域，特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了关键性作用。但仍存在一些挑战，例如：

(1)背景菌的影响，在mNGS报告结果中，要结合样本采集类型、微生物背景、患者的临床特征、传统病原体的检测报告和辅助检查等判断是定制菌、背景菌还是致病菌。

(2)胞内菌/真菌检出率低，主要由于胞内感染菌因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏低，比如结核分枝杆菌、军团菌、布鲁菌等；

(3)耐药检测存在一定困难，主要由于目前报道的耐药基因型与耐药表型的关联程度存在一些差距以及检测方法及检测成本的考虑导致耐药相关基因覆盖度较低；

(4)RNA病原体的检测，由于人体转录本身具有比基因组更高的丰度和复杂度，且RNA容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测存在一定困难。

目前市场上大都开展的基于DNA层面的mNGS检测，较少有基于RNA的宏转录组检测；可以开展宏基因组和宏转录组测序应用的，也是分DNA和RNA两部分单独检测，数据合并分析；或者，将RNA先经过逆转录和二链合成后，再与DNA混合，导致检测成本偏高，不利于检测应用的普及。

因此，有必要提供一种试剂盒，可以用于单管反应中同时进行DNA和RNA建库，既可以节省检测样本使用量，又可节省检测成本和周期。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于总核酸和宏基因组学构建病原微生物测序文库的方法及试剂盒。该方法在单管反应中同时进行DNA和RNA的建库，减少了构建步骤，同时还能使得在构建过程中更好地保留样本原有的核酸，因此，在对于样本量较少的情况而言，所述方法具有较高的应用价值。