[发明专利]用于检测转基因玉米DBN9958的RPA引物探针组合、试剂盒及检测方法

说明书

一种转基因玉米DBN9958的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法，根据外源插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米DBN9958成分的引物探针组合。以转基因玉米DBN9958基因组DNA为模板，利用该引物探针组合进行RPA扩增及实时荧光检测，具有速度快、特异性好、灵敏度高的特点。

技术领域

本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于检测转基因玉米DBN9958的RPA引物探针组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

转基因玉米DBN9958是北京大北农生物技术有限公司研发发的耐草甘膦及草丁膦除草剂的转基因玉米品种，是利用基因工程技术将epsps基因和pat 基因导入玉米中而获得的耐草甘膦及草丁膦除草剂的转基因品系。该品系已于2020年6月获得农业转基因生物安全证书(生产应用)，具有广阔的产业化应用前景。已报道的转基因玉米DBN9958的检测方法主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业设备，且PCR扩增和产物检测时间较长(约3～4h)，难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确的转基因检测新技术。

重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)，属于核酸等温扩增技术的一种。核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)是一种新型的扩增技术，恒定温度条件下即可进行反应，具有简便、快速、灵敏等优点，并可用于进行现场检验。RPA技术模拟了生物体内DNA的复制过程，重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合，形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子，对模板DNA序列进行比对并搜索出与之匹配的序列，在单链结合蛋白的帮助下，双链模板DNA解链，引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸，并形成新的 DNA。RPA荧光检测技术极大的缩短了反应时间。目前尚无利用RPA技术对转基因玉米DBN9958进行品系特异性的鉴定方法。

发明内容

本发明提供了一种检测转基因玉米DBN9958的RPA引物探针组合,该引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种转基因玉米DBN9958的RPA检测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物探针组合。

本发明还提供了一种转基因玉米DBN9958的RPA检测方法，该检测方法包括如下步骤：

以待测样品的基因组DNA为模板，利用前述的引物探针组合进行RPA扩增并进行荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品含有转基因玉米DBN9958成分。

进一步的，RPA扩增反应体系为每50μl反应体系中包括正向引物和反向引物各20pmol，探针5pmol，DNA模板50ng。

进一步的，RPA扩增反应体系为每50μl反应体系中还包括，再水化缓冲液29.5μl，280μM醋酸镁溶液2.5μl，余量为水。

进一步的，RPA扩增程序为39℃反应20分钟

本发明还提供一种前述的引物探针组合、检测试剂盒和/或检测方法在检测转基因玉米DBN9958的种子资源中的应用。

本发明首次提供了转基因玉米DBN9958品系特异性的RPA检测方法。本发明根据外源插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米DBN9958成分的引物探针组合。以转基因玉米DBN9958为模板，利用该引物探针组合进行荧光检测，可以得到明显的扩增曲线。本发明的RPA引物探针组合、检测试剂盒及检测方法具有速度快、特异性好、灵敏度高的特点。

附图说明