[发明专利]一种肝细胞培养基、培养方法及其用途

说明书

本发明涉及原代细胞体外培养领域，特别是涉及一种肝细胞培养基、培养方法及其用途。所述肝细胞培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括以下成分：液体基础培养基、半乳糖、胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠、脯氨酸、烟酰胺、鸟氨酸、转化生长因子α、表皮生长因子、地塞米松、Y‑27632、A‑83‑01、CHIR99021。本发明建立了原代肝细胞的长期体外扩增体系；肝细胞传代扩增培养时完全分化而不发生细胞退分化或转分化，降低了致癌风险，而且诱导成熟的肝细胞与原代肝细胞的肝功能差异小。

技术领域

本发明涉及原代细胞体外培养领域，特别是涉及一种肝细胞培养基、培养方法及其用途。

背景技术

肝细胞的体外培养对于推进肝脏细胞疗法、肝细胞死亡和肝脏再生机制以及肝脏疾病药物研究等都具有重要的意义。

目前已经报道了几种可以对肝细胞进行体外培养的方法，如Takeshi Katsuda课题组在2016年报道，可以通过在培养基中添加化学小分子Y-27632、A-83-01和CHIR99021实现大鼠和小鼠肝细胞的体外扩增，培养的细胞退分化为具有双潜能性的肝祖细胞，经过进一步诱导可以分化为肝细胞或胆管细胞。2018年，中国科学院上海生化细胞研究所惠利健课题组发现并报道，HM培养基可以诱导人肝细胞在体外以双潜能的形式传代扩增培养。2019年，北京大学邓宏魁教授实验室报道了一种通过添加5种小分子化合物使原代肝实质细胞在体外长期(大于4周)稳定培养的技术，然而该技术只能用于维持培养中的肝细胞的性能，而不能用于肝细胞的体外扩增。前期的这些报道揭示了肝细胞体外扩增培养的挑战性。目前已建立的肝细胞体外培养系统还不能实现真正的肝细胞体外扩增培养，而只能以先退分化传代再诱导其分化为目的细胞的形式进行。诱导成熟后的肝细胞虽然具有一定的肝功能，但是与原代肝细胞相比仍具有明显的差异。同时诱导的肝细胞存在分化不完全的可能性，因而具有潜在的致瘤风险。

基于这样的技术背景，建立功能性肝细胞长期体外传代培养的培养体系，实现肝细胞在长期传代的过程中仍保持其完全分化特征和功能是目前亟待解决的难题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肝细胞培养基、培养方法及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种肝细胞培养基，所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基以增殖培养基总量为基础计，包括以下成分：

液体基础培养基

优选地，所述肝细胞培养基还包括成熟培养基，所述成熟培养基以成熟培养基的总量为基础计，包括以下成分：

液体基础培养基

优选地，所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯可林。

优选地，所述弗斯可林的浓度为0.1μM～100μM，优选为1～50μM

优选地，所述肝细胞培养基中胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠为胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠的混合制剂。

优选地，所述Y-27632为Rho相关蛋白激酶抑制剂。

优选地，所述A-83-01为转化生长因子-β通路抑制剂。

优选地，所述CHIR99021为Wnt通路活化剂。

优选地，所述半乳糖的浓度为1.0～2.0g/L，更优选为1.6～2g/L；

优选地，所述脯氨酸的浓度为：0.1～1.0g/L，更优选为0.1～0.5g/L；

优选地，所述鸟氨酸的浓度为：0.01～0.3g/L，更优选为0.05～0.15g/L；