[发明专利]一种毒品原植物恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明针对恰特草叶绿体特异性序列设计引物和探针，建立恰特草特异性实时荧光PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高、可重复性良好等优点，最低检测下限为0.02％。有效的解决恰特草特异性快速检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫监管的恰特草及其产品的检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毒品原植物恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。

背景技术

恰特草(Catha134 edulis)，又名：巧茶、也门茶、阿拉伯茶、埃塞俄比亚茶等，属卫矛科(Celastraceae)巧茶属(Catha134)植物，产于东非和阿拉伯半岛等地区。其含兴奋化学物质卡西酮，对人体中枢神经具有刺激作用，长期嚼食会染癖成瘾，又被称为“东非罂粟”，具有严重的社会危害性。世界卫生组织将恰特草归类为Ⅱ类软性毒品。很多国家已将其列为兴奋剂或受管制药物，严禁旅客携带或邮寄入境。2014年，恰特草已列入《精神药品品种目录(2013版)》，被视为第一类精神药品，属毒品范畴，严禁携带入境。

恰特草作为一种新型的毒品原植物，外形似茶叶等植物。其经烘炒后的枝叶，外形酷似茶叶，形态上具有很高的伪装性，一些不法分子在高额利润的驱使下铤而走险进行非法走私与贸易。国内也陆续有查获的相关报道，如2016年青岛海关查获新型毒品恰特草，形似铁观音；原广州机场出入境检验检疫局于2012年查获干燥的“香椿叶”名义进口的恰特草一批。

目前口岸执法鉴定主要依靠传统的形态识别、质谱法和DNA条码法三类方法。

形态识别方法对于形态完整或新鲜的恰特草有一定的鉴别意义，但其鉴别需要形态学鉴别经验积累，技术推广较困难，不适合一线监管人员快速掌握，特别对于一些形态特征被破坏，外观不完整，或是加工混杂的产品，形态学的方法就难以适用这类情形，具有一定的局限性。

质谱方法主要检测恰特草中的卡西酮，新鲜的恰特草含有兴奋剂卡西酮和去甲麻黄碱，其中卡西酮结构不太稳定，采摘后72h内就会产生一定的分解，易分解成去甲伪麻黄碱和去甲麻黄碱，由于在干燥的恰特草中无法检出卡西酮，因此质谱方法存在一定的局限。郭海荣等建立了恰特草的质谱检测方法(郭海荣、郭鸣等，恰特草的气相色谱/质谱检测方法及成分变化[J].河北公安警察职业学院学报，2014,14(2):22-23)，该检测方法一般采用5.0g恰特草叶进行提取，提取过程包括用乙酸乙酯超声、浸泡过夜等，提取过程较复杂且时间较长，难以满足案件紧急时对检测周期的要求；所需样品用量较多，难以适应微量样品的情况，另外该方法需要质谱等大型检测仪器，价格昂贵。

DNA条码方法：申钰柯等采用DNA条形码进行恰特草的检测(申钰柯、刘栋业等，DNA条形码在新型毒品原植物恰特草种属鉴定中的应用研究[J].森林公安，2017,3:29-31)。其选择序列为卫茅科的通用保守基因rbcL的共有片段，(KX377451)，检测的步骤包括：通用引物的PCR扩增，电泳检测，外送测序公司进行测序，拟采用进化树方法进行比对分析遗传亲源关系，但目前该类保守基因可供分析比对的序列数据量少，该文中也未出示进化分析的数据。此外该类方法需经普通PCR、电泳、测序和进化树分析等过程，检测步骤繁琐，周期长，检测通量低，难以满足口岸监管部门对恰特草快速分类鉴定需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别毒品原植物恰特草及其制品特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物，所述的检测引物如下所示：

Catha134-F：5'-AGGTGTGATAAAAATGAGTCCCAGTA-3'(如SEQ ID NO.1所示)

Catha134-R：5'-TTTGGCGAGGGACTGAATAATC-3'(如SEQ ID NO.2所示)。