[发明专利]一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法

说明书

本案涉及一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法，包括斑马鱼的繁殖，利用Erastin溶液或枸橼酸铁铵溶液处理斑马鱼进行铁死亡模型的构建，使用台盼蓝对铁死亡模型进行验证，出现细胞死亡即成功构建斑马鱼铁死亡模型。本发明首次使用斑马鱼来定义和研究铁死亡现象，本发明发现，铁死亡诱导剂都能明显地增加斑马鱼体内的ROS产生，诱使细胞死亡数目明显增加，改变了铁死亡相关基因的表达。具有便利、快捷、成功率高，易重复等优点，能够实现铁死亡在个体水平的定性和定量，使斑马鱼能够成为便利的模型来研究铁死亡现象，以及铁死亡相关的癌症、血管、骨质疏松、代谢以及其他人类疾病的模型，也能为高通量筛选铁死亡相关的药物提供模型。

技术领域

本发明属于生物技术模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法。

背景技术

细胞死亡是哺乳动物的发育、内环境稳态的维持以及疾病发生的重要环节之一。铁死亡(Ferroptosis)是细胞死亡的一种方式，在细胞水平，和小鼠的水平已经研究较多。铁死亡是在谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)调控下铁依赖性细胞程序性死亡。2014年细胞死亡命名委员会正式命名，铁死亡有以下4点特征：细胞死亡与铁水平增加有因果关系，铁死亡过程需有铁的参与；脂质过氧化物增加和NADPH减少；线粒体有特殊形态改变；可被亲脂抗氧化剂和铁螯合剂逆转。铁死亡与多种病理性细胞死亡相关，例如一些退行性病例改变就是由于修复过氧化脂质的能力下降导致的细胞死亡；铁死亡可能具有肿瘤抑制功能，它可以去除无法获取关键营养因子或受感染以及因环境改变损伤的细胞。

斑马鱼是一种热带鲤科鱼，目前被广泛应用于新药筛选中。这是因为斑马鱼遗传背景清晰，与人类基因相似度高达87％，器官病变过程又与人类极为接近。同时，斑马鱼胚胎发育是全透明的，加上适当的色素抑制处理，可以清晰地观察病变过程，并且斑马鱼体型小、实验周期短，且维护费用低廉，非常适合于高通量实验。然而斑马鱼作为生物医学研究的第三大模式生物，还没有关于铁死亡的应用技术和方法。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明目的在于提供一种成本低、见效快、模型性能稳定，适用性广的斑马鱼铁死亡模型构建方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种斑马鱼铁死亡模型的构建方法，包括以下步骤：

1)斑马鱼的繁殖：将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1:2的比例放入交配鱼缸内，插上隔板，雌雄斑马鱼分开；隔夜后开灯换水，取出隔板，待30-60分钟后收集鱼卵；收集到的鱼卵置于含E3的培养皿中，挑选受精鱼卵，将受精鱼卵按100枚/盘的密度进行分盘，加入胚胎培养液，28℃恒温孵育5小时；

2)铁死亡模型的构建：挑选步骤1)中孵育正常的斑马鱼，按10-20条/孔的密度分布于6孔板中，加入E3培养液，28℃恒温孵育24h；除去E3培养液，将6孔板中的受精卵随机分为DMSO阴性对照组、Erastin处理组和枸橼酸铁铵(FAC)处理组，分别向其中加入DMSO、Erastin溶液和FAC溶液，恒温培养48h；

3)铁死亡模型的验证：使用台盼蓝对步骤2)中DMSO阴性对照组、Erastin处理组和FAC处理组的斑马鱼进行活体染色，检测到细胞死亡现象，即得到斑马鱼铁死亡模型。

进一步地，所述Erastin溶液的浓度为20μmol/L，FAC溶液的浓度为200μg/ml。

进一步地，所述步骤2)中，恒温培养的条件为28℃、避光处理。