[发明专利]一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法

权利要求书

1.一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板，其特征在于，包括质粒、构建于质粒上的需要导入的目的基因、靶序列上下游的同源性序列(同源臂)和guide RNA识别的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的供体DNA模板，其特征在于，所述质粒为pUC57、pUC57截短突变质粒pMini以及pMiniZ，pMini的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，pMiniZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。

3.根据权利要求1所述的供体DNA模板，其特征在于，目的基因的每一侧均具有一个同源性序列和guide RNA识别的DNA序列。

4.一种基于权利要求1所述DNA模板的目的基因定点插入方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、选取要定点插入目的基因的基因组位点，并根据位点以及所用基因编辑蛋白设计guide RNA；

步骤2、设计合成供体DNA模板，供体DNA模板含有目的基因、目的基因两侧的同源臂序列以及guide RNA识别的DNA序列；

步骤3、合成识别插入位点的guide RNA，表达纯化基因编辑蛋白；

步骤4、将步骤3中的guide RNA和基因编辑蛋白体外结合后，再与步骤2中带有目的基因和同源臂以及识别位点的质粒载体混合，最后与细胞混合，电转。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3中，质粒载体为pUC57截短突变质粒pMini，pMini的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基因编辑蛋白为SpCas9或LbCpf1或AsCpf1等。

7.根据权利要求4的方法，其特征在于，步骤2中同源臂大小为100-800bp。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤5中guide RNA和Cas9/Cpf1蛋白在体外室温或37℃结合10-20min。

9.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤5中的电转采用Celetrix或BTX电转系统。