[发明专利]一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法

说明书

本发明主要公开了一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法，其中，DNA模板包括质粒、构建于质粒上的需要导入的目的基因、靶序列上下游的同源性序列(同源臂)和guide RNA识别的DNA序列；然后利用电转技术将基因编辑蛋白和guide RNA的RNP复合体、DNA模板递送到细胞系或原代细胞，实现把目的基因定点插入到细胞系或原代细胞的基因组，对细胞系或原代细胞进行改造。该发明的一个实际应用是可以不依赖病毒生产定点插入的嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞，在免疫细胞治疗疾病的应用中具有更好的安全性和有效性。

技术领域

本发明涉及目的基因的定点插入，具体是利用电转技术结合基因编辑技术通过非病毒方法将目的基因定点整合到细胞系或原代细胞的基因组中，实施例中产生的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞可以用于白血病的治疗。

背景技术

目前主要是通过传统的慢病毒或逆转录病毒手段将目的基因整合到人原代T/NK细胞基因组中，但是该方法的不足之处是目的基因会被随机插入，如果能够将外源目的基因定点插入到细胞基因组中，能够在一定程度上提高基因工程改造过的人原代T/NK细胞的安全性和有效性，在临床上发挥更大的作用。目前，CRISPR-Cas9/Cpf1系统在实现对基因敲除方面已经运用的很成熟。但是通过CRISPR-Cas9/Cpf1系统实现将目的基因定点插入细胞系特别是原代细胞的基因组的技术，虽然已经有了一定的发展，但是插入的效率仍然很低。

目前在人原代T/NK细胞上，通过CRISPR-Cas9/Cpf1系统将目的基因定点整合到人原代T细胞的方法，主要是依赖于腺相关病毒(AAV)提供的单链DNA，作为Cas9/Cpf1定点切割基因组后同源重组修复(HDR)的供体DNA模板。但是腺相关病毒(AAV)在临床治疗过程中仍然可能会对机体产生潜在的危险、制备也较为复杂和不经济。目前还有研究将双链的线性DNA作为同源重组修复的供体DNA模板，对人原代T/NK细胞进行改造，但是双链的线性DNA制备较为复杂，且GMP制备不成熟。我们通过改造环状(circular)质粒载体DNA,使之成为同源重组修复的供体DNA模板，更高效地将目的基因定点插入到细胞系和人原代T/NK细胞的基因组中，从而实现目的基因在细胞系和人原代T/NK细胞基因组中的定点整合，增加免疫细胞治疗疾病的安全性和有效性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板及定点插入方法，本发明主要通过对CRISPR-Cas9/Cpf1定点插入系统中依赖的同源重组修复的供体DNA质粒载体模板进行改造，减小质粒载体的长度并在同源臂两端加入guide RNA识别的DNA序列(Cas9/Cpf1-cleavage sequence,CCS)，使得Cas9/Cpf1 RNP复合物能在定点切割基因组的同时把环状的供体DNA质粒载体切割成线性的供体DNA模板。该方法能够不依赖病毒递送同源重组修复的供体DNA模板，将基因定点整合到细胞系或人原代T/NK细胞的基因组中，此种方法制备的定点插入的CAR-T细胞与依赖AAV病毒产生的定点插入的CAR-T细胞具有同等的体外杀伤和体内抗肿瘤效果，实现了定点插入CAR-T技术的突破。

本发明采用以下技术方案：

一种用基因编辑改造原代细胞的DNA模板，包括质粒、构建于质粒上的需要导入的目的基因、靶序列上下游的同源性序列(同源臂)和guide RNA识别的DNA序列。

进一步地，所述质粒为pUC57、pUC57截短突变质粒pMini以及pMiniZ，pMini的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，pMiniZ的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。

进一步地，目的基因的每一侧均具有一个同源性序列和guide RNA识别的DNA序列。其中，基因编辑蛋白通常为Cas9/Cpf1，可将guide RNA的DNA序列表示为Cas9/Cpf1-cleavage sequence,CCS。

本发明还提供了一种基于权利要求1所述DNA模板的目的基因定点插入方法，包括如下步骤：