[发明专利]一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法

权利要求书

1.一种评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法包括以下步骤：

步骤一，抽取确诊为脓毒症且无其他免疫疾病的患者的静脉血，将静脉血置于离心管中；将盛有静脉血的离心管置于离心机内离心；

步骤二，将离心管置于恒温水浴箱内，设定水浴温度为37℃，静置4～5min；使用玻璃小滴棒将纤维蛋白剥离到离心管的管壁上，同时将离心管再次置于离心机中进行二次离心；

步骤三，取1ml血清样本置于离心管中，加入2ml Trizol Reagent，振荡使二者融合，静置后进行剧烈振荡至离心管内无沉淀物；

步骤四，在离心管内加入1ml氯仿，振荡使二者融合，静置直至出现分层；将分层液体置于离心机中，设定离心温度为4℃、离心转速为6000～8000r/min进行10～12min离心，弃除上清液；

步骤五，在离心管中加入3ml乙醇，振荡后将离心管置于离心机内，设定离心温度为4℃，离心转速为8000～10000r/min进行3～5min离心，弃除上清液；对离心管内的液体进行干燥，至离心管内无液体残留；

步骤六，在离心管中加入RNase水，在55～60℃环境内孵育10～15min，进行血清样品中RNA的提取，得到RNA样本；

步骤七，检测RNA样本的RNA纯度，将检测结果与预设纯度进行对比，并将符合纯度要求的样本置于冰箱中在-80℃环境下进行保存；

步骤八，将步骤七保存的RNA样本取出，将RNA样本反转录合成cDNA，进行标记cRNA的合成；

步骤九，将步骤八得到的合成的cRNA溶于结合缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，以超声破碎仪震破细胞，于4℃环境下离心15～20min，移除细胞碎片，过滤上清液；

步骤十，将步骤九过滤后的上清液注入已事先通过结合缓冲液的金属螯合层析管柱，清洗缓冲液清洗管柱，以冲洗缓冲液冲洗，得到纯化物，并进行cRNA片段化；

步骤十一，将片段化的cRNA与芯片进行杂交，洗涤，进行芯片扫描，进行杂交后IncRNAs的检测，并依照预设标准进行符合要求的IncRNAs的初步筛选，得到多个评价脓毒症的生物标志物；

步骤十二，对得到多个评价脓毒症的生物标志物的诊断价值进行验证，扩大样本评价候选标志物对脓毒症的诊断价值，并对诊断价值进行排序；

步骤十三，选择诊断价值最高的生物标志物作为评价脓毒症的生物标志物，并对该生物标志物进行敏感度和特异度的测定，完成所述评价脓毒症的生物标志物的筛选。

2.如权利要求1所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤一中，所述将盛有静脉血的离心管置于离心机内离心的条件为：设定离心速率为2000～2500r/min，离心时间为3～5min。

3.如权利要求1所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤二中，所述将离心管再次置于离心机中进行二次离心的条件为：设置离心速率为3000～3500r/min，离心时间为2～3min。

4.如权利要求1所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤七中，所述检测RNA样本的RNA纯度时，使用Nano Drop-2000进行检测。

5.如权利要求1所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤七中，所述预设纯度为1.26～1.42。

6.如权利要求1所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤八中，所述将RNA样本反转录合成cDNA的方法为：

(1)将RNA样本在4℃环境下进行解冻；

(2)将RNA反转录为cDNA；

(3)采用聚合酶链式反应的方式不间断地对cDNA进行扩增。

7.如权利要求6所述评价脓毒症的生物标志物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述将RNA反转录为cDNA的条件为：设定反转录所需温度为50～60℃、反转录时间为20～25min。