[发明专利]一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Bacillus stearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到了歧化水解比以及歧化反应催化效率提高的突变体；突变体L277M的歧化活力与水解活力的比值与野生型相比，比野生酶提高了142.98％，突变体L277M的歧化反应催化效率是野生酶的1.71倍。采用本发明所构建的突变体能够降低生产成本，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2，GH13_2)，能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应以及水解反应。其中，转糖苷反应包括歧化反应、环化反应及偶合反应。歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应，环化反应是分子内发生的转糖苷反应，偶合反应是环化反应的逆反应。在实际应用中，常利用CGTase歧化反应生成多种水溶性、稳定性提高的糖苷化合物，如L-抗坏血酸、橙皮苷、柚皮苷的糖基化产物。然而，已发现的所有天然来源的CGTase均同时具有歧化和水解活性，水解反应作为副反应会降低转糖苷产物的产量。因此，在工业生产中CGTase的水解活性应该尽可能的降低。

目前，CGTase很难进一步提高其歧化反应效率。大多数的突变体不能同时兼顾提高歧化活力和降低水解活力。歧化水解比或歧化反应效率的提高可以有效的提高产量，是工业生产中需要解决的一大难题。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过对来源于Bacillusstearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，以获得歧化水解比或歧化反应催化效率提高的突变体，将突变体应用于工业生产。

本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体为：将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位的由亮氨酸突变为甲硫氨酸，并命名为L277M，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于Bacillusstearothermophilus NO2。

本发明还提供了一种编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET系列载体、Duet系列载体、pGEX系列载体、pHY300系列载体、pHY300PLK系列载体、pPIC3K系列载体或pPIC9K系列载体。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。

本发明还提供了一种携带上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因或上述表达载体的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

在本发明的一种实施方式中，所述携带上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因或上述表达载体的微生物细胞的构建方法为：将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体L277M的歧化活力由4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基和麦芽糖来测定。