[发明专利]生物样本中类固醇激素的检测方法及该方法所用试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种生物样本中类固醇激素的检测方法及该方法所用试剂盒。该方法包括：富集所述生物样本中的类固醇组分；以分子量低于100的羟胺为衍生化试剂对所述类固醇组分进行衍生化处理；所述羟胺的浓度为200mM～400mM、反应温度为50℃～70℃，反应时间为40min～80min；使用SPE色谱柱对衍生化处理后单组分进行纯化；使用MALDI‑MS对类固醇激素进行检测。本发明基于HA衍生化的MALDI‑MS方法首次用于复杂生物样品中类固醇激素的定量检测，特异性高、方法准确、操作简便，且灵敏度高。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种生物样本中类固醇激素的检测方法及该方法所用试剂盒。

背景技术

类固醇激素是一类具有多个羰基和羟基取代基的环戊烷多氢菲衍生物。在生物体中，类固醇激素调节各种生理过程如水盐平衡、葡萄糖代谢、蛋白质代谢、脂质代谢和炎症、免疫功能。类固醇激素代谢失衡可能导致原发性醛固酮增多症、库欣综合症和先天性肾上腺增生等疾病。准确定量生物样品中的激素水平具有重要的临床意义。雌酮、睾酮和孕酮这一类重要的性激素会极大地影响性功能、血管功能和能量稳态。准确定量和监测这些性激素的动态变化对于性早熟、不孕症、性腺机能减退、心血管疾病和2型糖尿病等与性激素紊乱有关疾病的临床诊断至关重要。

通常临床上鉴定和定量类固醇激素的主要方法有放射免疫测定法、酶联免疫吸附法和化学发光免疫法。然而，缺乏合适的特异性的抗体以及抗体的交叉反应降低了反应的准确性和特异性，使得不同免疫测定方法测量值不一致。此外，血浆中某些激素的浓度低于免疫分析的LOD。因此，应提高类固醇激素检测方法的灵敏度和准确性。

高信息量、高灵敏度且准确的质谱MS是一种无需使用免疫试剂即可直接测量分析物的无标记方法。气相色谱-质谱联用GC-MS和液相色谱-质谱联用LC-MS已用于定量血浆或血清样品中的类固醇激素，具有足够的灵敏度和较高精确度，表明质谱是一种可靠的方法。在临床质谱领域，MALDI-MS是一种高通量、自动化的MS检测方法，具有灵敏度高、稳定性好、实验周期短、样品和人力消耗少的优点，对于临床上定量类固醇激素有潜在价值。但是类固醇激素的质谱检测主要问题是缺乏极性基团导致激素分子的电离效率低，大大降低了MS检测的灵敏度。衍生化方法的出现将阳离子电荷引入分子来提高检测灵敏度。已有报道关于类固醇激素标记的各种衍生化试剂，包括吉拉德试剂T(GT)、吉拉德试剂P(GP)、N-甲基吡啶-3-磺酰(NMPS)、和双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，给羰基的衍生物带来稳定的电荷。

发明内容

为了克服现有方法的不足，本发明提供了一种羟胺(hydroxylamine,HA)衍生化(HA-D)/MALDI-MS新方法，用于测定血浆中(特别是低浓度)的类固醇激素。

本发明涉及一种生物样本中类固醇激素的检测方法，包括：

a)纯化和富集所述生物样本中的类固醇组分；

b)以分子量低于100的羟胺为衍生化试剂对所述类固醇组分进行衍生化处理；

所述羟胺的浓度为200mM～400mM、反应温度为50℃～70℃，反应时间为40min～80min；

c)使用SPE色谱柱对衍生化处理后单组分进行纯化；

d)使用MALDI-MS对类固醇激素进行检测。

HA可以与类固醇分子上的酮羰基发生反应，将类固醇激素转化为相应的肟，肟易于形成[M+H]⁺加合物，大大提高了质谱检测类固醇激素的灵敏度。

为了优化HA-D/MALDI-MS方法的分析性能，本发明系统地研究了HA的浓度、衍生化条件和纯化步骤。结果表明，所建立的HA-D/MALDI-MS方法可用于临床上测定复杂生物样品中的类固醇激素。