[发明专利]酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法

权利要求书

1.一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：步骤如下：

⑴设计上、下游引物，引物两端加上I-SceI识别位点，用上、下游引物将酿酒酵母诱导型启动子控制的I-SceI基因的表达盒及KanMX筛选基因GAL-I-SceI-KanMX从质粒pGSKU扩增下来；

⑵设计第二段引物进行第二次PCR扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp；

⑶使用转化方法，将PCR扩增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功；

⑷含有GAL或其他启动子所控制表达I-SceI基因的酵母，激活启动子时，就能够表达I-SceI内切酶，进而识别两端预先放置的I-SceI识别位点并进行切割，从而产生双DSB。

2.根据权利要求1所述的酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：所述步骤⑴中上游引物为SEQ NO.1，下游引物为SEQ NO.2；

DNA聚合酶反应体系：ddH₂O 15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA聚合酶0.5μl，2.5mM的dNTP 1μl，10×Pfubuffer 5μl，DNA模板1μl；

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

3.根据权利要求1所述的酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：所述步骤⑵中上游引物为SEQ NO.3，下游引物为SEQ NO.4；

DNA聚合酶反应体系：ddH₂O 15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA聚合酶0.5μl，2.5mM的dNTP 1μl，10×Pfubuffer 5μl，DNA模板1μl；

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

4.根据权利要求1所述的酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：所述步骤⑶中上游引物为SEQ NO.5，下游引物为SEQ NO.6。

5.根据权利要求1所述的酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：所述步骤⑴中酿酒酵母诱导型启动子为半乳糖启动子GAL、己糖转运载体或乙醇脱氢酶Ⅱ。

6.根据权利要求1所述的酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：所述步骤⑴中能够根据需要通过重叠延伸PCR引入一段无用序列，从而调节两个DSB的间隔距离。

7.根据权利要求1至6任一项所述的酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，其特征在于：所述步骤⑴中I-SceI基因的表达盒包括半乳糖启动子、I-SceI内切酶、KanMX/潮霉素/诺尔斯菌素筛选标记。