[发明专利]酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法

说明书

本发明涉及一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，将GAL‑I‑SceI‑KanMX转化盒通过化学转化法将其整合到酿酒酵母基因组上，即可构成该模型。本发明通过激活启动子表达I‑SceI内切酶，识别两端I‑SceI识别位点进行切割，从而能同步诱导两个不同间距的DSB的产生，排除其他损伤类型的干扰，更重要的此模型可用于研究同步产生的“聚集型”DSB，“聚集型”DSB是癌症放疗及众多化疗药物所产生的特征损伤类型，这一模型是研究细胞信号通路及药物毒理的强大工具。并且本发明稍作改进可同步产生多个DSB，可应用于人类或其他生物的细胞。

技术领域

本发明属于基因工程技术，尤其是一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法。

背景技术

DSB是一种非常严重的DNA损伤，若不及时修复，则会导致基因突变、诱发癌症等。DSB主要通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)来进行修复，构建可化学或物理诱导的DSB是研究上述DNA损伤途径必不可少的工具。传统的DNA损伤模型多用电离辐射、化学诱变剂等来诱导，并不能很好地将损伤类型限制在单一DSB损伤，还常常伴随DNA单链断裂(SSB)、碱基突变以及DNA双链交联等。此外，自然条件下细胞内DSB的产生通常不止一个，研究多个DSB同步产生时的毒理作用，以及机体的修复过程，具有重要的生物医学基础理论意义和使用价值。

如图1所示，电离辐射、化学诱变剂等外界因素诱导的DNA损伤类型复杂，且位点随机，无法有效研究HR、NHEJ等特定修复DSB的分子信号通路。本文构建了一个能稳定诱导产生双DSB定点产生的模型，两个DSB的间隔距离可根据需要改变，因而不仅可以排除其他损伤类型的干扰，更重要的是可研究同步产生的“聚集型”DSB相对于单个DSB，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程。鉴于“聚集型”DNA损伤是癌症放疗及众多化疗药物所产生的特征损伤类型，这一模型是研究细胞信号通路及药物毒理的强大工具。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种定点同步双DSB模型的构建方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法，步骤如下：

⑴设计上、下游引物，引物两端加上I-SceI识别位点，用上、下游引物将酿酒酵母诱导型启动子控制的I-SceI基因的表达盒及KanMX筛选基因GAL-I-SceI-KanMX从质粒pGSKU扩增下来；

⑵设计第二段引物进行第二次PCR扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp；

⑶使用转化方法，将PCR扩增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功；

⑷含有GAL或其他启动子所控制表达I-SceI基因的酵母，激活启动子时，就能够表达I-SceI内切酶，进而识别两端预先放置的I-SceI识别位点并进行切割，从而产生双DSB。

而且，所述步骤⑴中上游引物为SEQNO.1，下游引物为SEQNO.2；

DNA聚合酶反应体系：ddH₂O15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA聚合酶0.5μl，2.5mM的dNTP1μl，10×Pfubuffer5μl，DNA模板1μl；

DNA聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。

而且，所述步骤⑵中上游引物为SEQNO.3，下游引物为SEQNO.4；