[发明专利]一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法、试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其具体包括如下步骤：

(1)质粒构建：将人工合成的GenBank中收录的ASFV P72核酸序列插入载体PMD18-T质粒构建得到PMD18-T-P72质粒，置于-20℃保存备用；

(2)环介导等温扩增反应：将获得的PMD18-T-P72质粒在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应，扩增反应体系中包括10x Buffer 2.5μL，MgSO4(100μM)1.5μL，dNTP Mix(10μM)3.5μL，内引物F2、B2(40μM)1μL，外引物F3、B3(5μM)1μL，环引物Loop B(10μM)1μL，BstDNA聚合酶(8000U/mL)1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH₂O补足至25μL；其中内引物F2的序列如SEQ.No 1所示，内引物B2的序列如SEQ.No 2所示，外引物F3序列如SEQ.No 3所示、外引物F3B3序列如SEQ.No 4所示，环引物Loop B如SEQ.No5所示；其中环引物Loop B的5’端进行生物素标记；

(3)LFD检测：向反应后的环介导等温扩增反应体系中加入1μL(10μM)经异硫氰酸荧光素标记的探针F1c，其中探针F1c序列如SEQ.No 6所示；在63℃下杂交5min；反应结束后取5μL反应产物加入95μL无菌PBS溶液中，混匀，将横向检测试纸条检测端垂直插入待测液中，静置5min，肉眼观察结果。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应最佳体系中聚合酶浓度为320U/mL、甜菜碱浓度为1.0M、MgSO₄浓度为8mM。

3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，环介导等温扩增反应的反应温度为63℃至65℃。

4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，环介导等温扩增反应的反应时间为60min。

5.一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测试剂盒，其包括：

(1)PMD18-T质粒；

(2)环介导等温扩增反应体系25μL，包括10x Buffer 2.5μL，MgSO4(100μM)1.5μL，dNTPMix(10μM)3.5μL，内引物F2、B2(40μM)1μL，外引物F3、B3(5μM)1μL，环引物Loop B(10μM)1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH₂O补足至25μL；其中内引物F2的序列如SEQ.No 1所示、内引物B2的序列如SEQ.No 2所示，外引物F3序列如SEQ.No 3所示、外引物F3B3序列如SEQ.No 4所示，环引物Loop B如SEQ.No 3所示；其中环引物Loop B的5’端进行生物素标记；

(3)异硫氰酸荧光素标记的探针F1c；

(4)横向检测试纸条。

6.一种权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)将样本DNA提取后插入载体PMD18-T质粒构建得到PMD18-T-P72质粒，置于-20℃保存备用；

(2)将获得的PMD18-T-P72质粒在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应；

(3)向反应后的环介导等温扩增反应体系中加入经异硫氰酸荧光素标记的探针Flc在63℃下杂交5min；反应结束后取5μL反应产物加入95μL无菌PBS溶液中混匀，将横向检测试纸条检测端垂直插入待测液中静置5min后肉眼观察结果。

7.根据权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，样本DNA的提取可以采用DNA提取试剂盒提取或者采用常规DNA提取方法进行提取。