[发明专利]一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及一种运用环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法结合的方法即时检测非洲猪瘟病毒的检测方法，属于传染病检测领域。为了克服现有非洲猪瘟病毒检测方法的不足，本发明提供一种非洲猪瘟病毒的即时可视化检测方法，其是运用环介导等温扩增方法同时联合横向流动试纸条检测ASFV，建立LAMP‑LFD方法检测ASFV。LAMP与LFD相互结合的技术，使LAMP扩增产物的检测可视化，检测结果明显直观，并具有高特异性、高灵敏度、操作简单的特点，适用于基层和现场使用。

技术领域

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒的即时可视化检测方法，具体涉及一种运用环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条法(LFD)结合的方法即时检测非洲猪瘟病毒的检测方法，属于传染病检测领域。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起地家猪和野猪的一种急性的高度接触性传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，为双股DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径为20nm，外包囊膜，内部含有数个共同轴心的同心圆结构。不同日龄的猪群均易感，潜伏期一般为5-15天，发病过程短。临床症状与猪瘟(Classical swine fever，CSF)极为相似，表现为高热、皮肤发绀、淋巴结和胃肠黏膜等内脏实质器官出血、呼吸障碍和神经症状。

该病传播速度快，死亡率可高达100％，在我国被列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，已引起世界范围的广泛关注。ASF于1921年首次在非洲肯尼亚发现，随即在非洲、欧洲和美洲等几十个国家爆发。2018年8月3日，我国第一起ASF疫情在辽宁省沈阳市某养殖场被确诊，截至11月23日，我国已经确诊85起家猪ASF疫情；从首例确诊到85起疫情，短短112天，纵跨大半个中国，我国ASF疫情形势严峻。但目前ASF没有特效的疫苗和药物用于防控和治疗，一旦确诊，防止疫情扩散的唯一有效方法就是扑杀并无害化处理。因此建立一种简单快速、准确有效的ASFV诊断方法显得尤为重要。

目前常用的ASFV检测技术有红细胞吸附试验(HAD)、直接免疫荧光试验(DIF)、聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR(qRT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。HAD具有敏感性和特异性，适用于较宽范围的检测，因此目前常用此方法检测ASFV并用以评估疑似暴发疫情，但HAD法检测耗时长、操作不便，且部分毒株不能产生红细胞吸附现象。DIF检测急性ASF敏感性高，且快速经济，但检测亚急性或慢性的ASF时敏感性差。而基于PCR方法的核酸检测技术常用的有常规PCR和荧光定量PCR，虽然两者都能够准确诊断，但对于人员和设备要求很高，需要在实验室进行诊断，且需要昂贵的PCR仪和专门的实验耗材，对于猪场现场检测和偏远地区早期疫情的监控并不实用。

LAMP是日本学者Notomi于2000年在Nucleic Acids Res杂志上发表的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。无需高端仪器和复杂反应程序，反应条件为恒温(60℃～65℃)、反应时间为30min到60min，即可将所需目的基因扩增到10⁹拷贝数。LFD检测方法是结合免疫层析技术和分子生物学手段，在试纸条上形成有颜色的检测线，可以特异性地检测出目标产物。

有鉴于此，本发明提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法、试剂盒及其使用方法。

中国专利申请CN201911216202.9本发明提供了一种非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂，本发明建立基于ASFV p17蛋白的编码基因D177L的TaqMan实时荧光定量PCR检测体系，通过条件优化得到较为理想的扩增曲线和检测效果，与传统PCR检测方法相比，具有特异性更强、灵敏度更高、重复性更好、自动化程度更高反应更快等优点，且不需要电泳及紫外检测耗时更短、结果更加直观。但其操作过程相对复杂，检测要求相对苛刻，不适于实验条件较差区域的病毒快速检测。