[发明专利]一种靶向型针对LRRK2的siRNA表达质粒及其在帕金森氏症方面的应用

说明书

本发明公开了一种靶向型抑制LRRK2基因的siRNA表达质粒，这种表达质粒将狂犬病毒糖蛋白(RVG)与针对LRRK2基因的siRNA组合表达。尾静脉注射这种质粒后，在脑组织中基因表达水平下降；相关炎症得到缓解；对PD转基因小鼠尾静脉注射这种质粒一段时间，可以有效缓解小鼠的疲劳转棒、爬杆实验指标的恶化，即缓解小鼠的运动异常。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及神经系统靶向肽段和针对LRRK2的siRNA的组合在体内的自组装表达，以及该方法在帕金森氏病治疗方面的应用。

背景技术

帕金森氏症(PD)是引起运动障碍的主要神经退行性疾病之一，其特征是黑质的多巴胺能神经元逐渐丧失，并与由α-突触核蛋白和其他蛋白质(路易体和路易神经突)组成的纤维状聚集体形成有关。主要临床表现为症状的不对称发作(帕金森氏病通常始于身体的一侧)；存在静息性震颤。如果不及时治疗，则症状会导致残疾、严重的行动不便和摔倒并逐渐恶化^[1]。因此，寻找安全有效的治疗方法十分重要。

LRRK2错义突变是常染色体显性遗传PD的最常见原因，LRRK2突变导致激酶活性升高，抑制富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)活性代表了最有前途的治疗策略之一，蛋白激酶是有吸引力的药理学靶标，因此选择性抑制LRRK2可以预防或延迟PD的发作^[2]。ASO降低LRRK2mRNA水平并抑制其翻译的治疗方法已在临床上取得初步成功，但是ASO需要通过鞘内注射给药，该给药方法有一定的创伤性。此外，ASO价格昂贵，绝大多数PD病人无法负担。

早在90年代的时候，就有大量研究表明尾静脉注射质粒，可以实现质粒在肝组织的表达。我们前期的实验结果发现，尾静脉注射表达siRNA的质粒分子，siRNA可以在多个组织如肝、肺、肾、脾、胃等组织中检测到，但其前体分子仅能在肝组织中检测到，提示质粒分子可能在肝细胞中进行表达^[3]，并将siRNA分泌到其他组织中；检测血清和血清外泌体中的siRNA含量发现，血清中的siRNA分子几乎全都集中于血清外泌体中^[4]。以上结果提示，肝细胞可以对外源质粒分子进行加工表达，产生siRNA，再以外泌体的形式将siRNA分子分泌到其他组织器官。嗜神经性的狂犬病毒糖蛋白(RVG)可以赋予外泌体靶向能力，使外泌体通过血脑屏障进入神经系统发挥作用^[5]。这种实现siRNA自体生产和运输的技术方法很大程度上解决了目前siRNA生产成本高、易降解的问题，同时给药方式也较为简单，是一种低成本、高效率的干扰药物生产递送方式^[6]。

发明内容

目前取得初步成功的ASO治疗法其缺点在于给药困难，价格昂贵。本发明主要解决的技术问题是提供一种给药方式较为简单，低成本、高效率的干扰药物生产递送方式。

将嗜神经性的狂犬病毒糖蛋白(RVG)序列和LRRK2 siRNA在质粒中组合，通过静脉注射进入体内，带有这段序列的质粒在体内可以自主产生siRNA并进行包装，随血液循环运输，在经过脑毛细血管时可以通过血脑屏障进入神经系统，从而抑制脑组织中HTT蛋白的表达，改善运动协调能力。

本发明的有益效果是：1、解决了目前ASO治疗法给药困难的问题，操作简单，同时可以减轻痛苦。2、该方法的成本较低、可以实现普及。3、利用该发明对PD转基因小鼠进行治疗，可以有效缓解小鼠的疲劳转棒、爬杆实验指标的恶化，改善其行为异常，是一种有效的治疗方法。

附图说明

图1是本发明的质粒骨架图。

图2 LRRK2 siRNA/RVG质粒干扰效率检测

图3是质粒分子表达的siRNA在体内对LRRK2的抑制效果。

图4是LRRK2 siRNA/RVG质粒分子对PD转基因小鼠运动能力的改善效果。

具体实施方式